0基础教程 | Oligo 7 设计和分析PCR引物的保姆级教程（带Oligo 7安装包）

科研根号三

2024年11月13日 20:15

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关于PCR实验如果有任何疑问，可以加一下我们的实验学习互助群，群内有技术老师也有很多其他正在做PCR的同学，大家可以一起交流经验~

Oligo 7设计的引物对引物有一个综合评价，同时概括了引物关键信息，可分析引物的二聚体形成、发夹结构、上游&下游引物和产物各个碱基的组成比例和Tm值、错配情况、PCR总览、内部稳定性等，通过这些分析可以确保自己的引物是不是最合适的。

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这里分享的Oligo 7实测不会出现闪退或者是点search退出的情况，非常好用哦！

Oligo 7 引物设计

1、查找基因序列

以human p53 为例进行引物设计，p53在human中的基因名为TP53。

打开NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），数据库选择Gene，搜索框输入“TP53 human”，点击Search。

检索结果第一条就是我们要找的TP53 基因，点击进入下一页面。

点击右侧边栏的NCBI Reference Sequences (RefSeq)查看序列信息。

点击【NM_000546.6】进入下一个页面。

往下翻，找到【CDS】，点击进入下一个页面。

如下页面点击右下角【FASTA】。

下面框出来的就是我们需要的p53基因序列，复制序列信息。

2、设计引物

打开 oligo 7，菜单栏File→New→ Sequence，或者快捷键Ctrl+N，都可以调用出序列粘贴窗口，然后将目的序列粘贴进来，点击回车或者是如下图所示的√，开始设计引物。

Search 菜单下，选择 for primes &probes ，调用出引物查找窗口。

根据自己的实际情况，选择Parameters 设置引物的相关参数。

选择Constraints，Primer Length选项设置引物长度，Primer Im Range选项设置解温度。设置完之后点击OK。

点击Ranges设置引物范围。

PCR product length栏目根据自己的需求设置引物长度，然后点击OK。

然后点击 Search 即开始进行引物的搜索，之后会出现oligo所列出的按照得分（Score）高低排列设计的引物。

3、引物分析

双击每一行所列出的引物会弹出该对引物和产物的基本信息，以及对PCR反应的评价。

点击Sequence页面可以查看引物的详细信息。点击绿色方形图标前面的 i 图标可了解对应的具体信息。

接下来是Analyze 功能菜单下对该引物的具体分析。

这里可以看到引物的概括信息、引物的二聚体形成分析、发夹结构分析、上游&下游引物和产物各个碱基的组成比例和Tm值、错配情况、PCR总览、内部稳定性等这些项目的详细分析，通过这些分析可以确保自己的引物是不是最合适的。

Analyze→Key info：点击Selected primers，会给出两条引物的基本信息，基本信息包括引物的 Tm值，Oligo是采用nearest neighbor method计算Tm值，会比Primer5中引物的Tm值略高一点。这里需要确保3`△G|≤9kcal/mol，以防止在错配位点形成双链结构引起DNA聚合反应。如果没有问题就继续往下分析。

Analyze→Duplex Formation：这里是指二聚体形成分析，可以选择“Forward Primer”,“Reverse Primer”，分析上游引物或下游引物的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其△G值应该偏低，一般△G≤4.5kcal/mol，（结合碱基对）hydrogen bonds≤3。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和△G 值。

Analyze→Hairpin Formation：接下来是夹结构分析，可以选择上游或者下游引物，同样，△G≤4.5kcal/mol，（结合碱基对）hydrogen bonds≤3。

Analyze→Compositionand Tm：这里会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm 值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbormethod、％

GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是 Primer5所采用的方法，Tm 值可以控制在50～70度之间。

Analyze→False Priming Sites：这里是错误引发位点分析，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo 详细，而且oligo会给出正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，如果正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。

Analyze→PCR：这是最有参考价值一项，这里是基于这对引物的PCR反应总结，同时给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价（Comments）。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且△G值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。