铁死亡（Ferroptosis）：是一种新型程序性细胞死亡形式，为铁依赖性脂质过氧化物的积累所导致。铁死亡发生机制主要与铁代谢紊乱、氨基酸抗氧化系统失衡、脂质过氧化物集聚有关。
铁死亡发生机制
1.氨基酸抗氧化系统失衡
生理条件下，system XC-由溶质转运家族7A11(SLC7A11)和SLC3A2组成，将胱氨酸运输至细胞内并被还原为半胱氨酸，用于合成细胞内主要的抗氧化剂GSH。 GSH是GPX4的一个必要辅因子，可将还原型GSH转化为氧化型GSH，同时还原脂质过氧化物，从而减轻氧化应激损伤。 因此，system XC-和GPX4是铁死亡氨基酸代谢中的重要调控靶点。
2.铁代谢紊乱
血液循环中的Fe3+与转铁蛋白结合并运输，通过转铁蛋白受体1进入细胞后被还原并释放到胞质的不稳定铁池(LIP)中，而多余的铁贮存在铁蛋白中。（转铁蛋白与转铁蛋白受体1 为关键蛋白）。 胞内LIP，主要以Fe2+的形式存在，由于Fe2+的不稳定性和高反应活性，铁通过芬顿反应产生羟自由基，可直接与细胞膜、质膜中的多不饱和脂肪酸反应，产生大量脂质ROS，导致细胞死亡。
3.脂质过氧化物集聚
脂质过氧化物集聚是铁死亡的核心机制。 铁死亡过程中多不饱和脂肪酸如花生四烯酸(AA)或肾上腺酸(AdA)是最容易发生氧化反应的脂质，且受三种合成酶调控。 乙酰辅酶A合成酶长链家族4(ACSL4)将AA或AdA催化为花生四烯酰-辅酶A和肾上腺酰-辅酶A，然后溶血卵磷脂酰基转移酶3 (LPCAT3)将其酯化为磷脂酰乙醇胺(PEs)形成AA-PE和AdA-PE，最后经脂肪氧合酶氧化为脂质过氧化物。
铁死亡特征
细胞形态特征：铁死亡会导致细胞线粒体萎缩变小，嵴减少甚至消失，膜密度增高，细胞膜断裂和出泡，细胞核形态变化不明显。
细胞成分特征：铁死亡表现为脂质过氧化增高，活性氧(ROS)升高，铁离子聚集。
铁死亡研究思路
Deubiquitinase USP35 modulates ferroptosis in lung cancer via targeting ferroportin.
题目四要素：疾病（lung cancer）、表型(ferroptosis)、主变量分子(USP35)、机制(ferroportin)四部分内容。
1.现象
USP35基因的敲低可抑制肺癌细胞的生长、集落的形成和肿瘤的进展。 实验：CCK8检测，细胞克隆形成，肿瘤变化检测，WB检测，qPCR检测。
2.本质
当干扰USP35的基因表达后，细胞活力下降，通过各种细胞死亡抑制剂处理后，发现细胞坏死，凋亡以及自噬抑制剂对细胞活力下降没有影响，但是铁死亡抑制剂能够缓解细胞死亡现象，初步考虑USP35影响细胞的铁死亡现象，然后通过铁死亡相关指标检测发现USP35敲低后，细胞铁死亡指标发生明显变化。 实验：CCK8检测，细胞克隆形成，脂质活性氧检测，HETEs检测，GSH以及GPX4检测，LIP检测。
Nec-1：细胞坏死抑制剂
Z-VAD：细胞凋亡抑制剂
CQ：自噬抑制剂
Fer-1：铁死亡抑制剂
Lip-1：铁死亡抑制剂
DFO和CPX是铁螯合剂
3.验证
过表达USP35对癌细胞以及体内肿瘤没有明显作用；当处理铁死亡诱导剂的同时过表达USP35能发现不论是细胞还是在体肿瘤都进一步发展。USP35过表达阻断了erastin/rsl3介导的肿瘤抑制作用。 实验：CCK8检测，qPCR检测，细胞克隆形成，体内肿瘤实验
Erastin和RSL3铁死亡诱导剂
USP35的过表达能缓解Erastin和RSL3引起的铁死亡；能够降低Erastin和RSL3引起的铁蓄积，但对GSH和GPX4没有明显影响。
实验：脂质活性氧检测，HETEs检测，GSH以及GPX4检测，LIP检测，Fe2+检测。
Erastin和RSL3铁死亡诱导剂
在H1650细胞中干扰USP35能够引起细胞活性减低和肿瘤生长抑制，并通过铁死亡指标发现是铁死亡现象；
用Erastin和RSL3处理引起癌细胞铁死亡的同时过表达USP35能够促进细胞增殖和肿瘤发展，改善铁死亡现象。
实验：qPCR检测，CCK8检测，在体肿瘤检测，脂质活性氧检测，GSH以及GPX4检测，LIP检测，Fe2+检测
Erastin和RSL3铁死亡诱导剂
4、机制
USP35不影响GSH代谢相关蛋白也不影响cystine摄取，但是影响铁转运蛋白FPN（ferroportin）；过表达USP35降低了肺癌细胞内的LIP和Fe2+，而在FPN缺陷的细胞中却没有降低。此外，在敲除内源性FPN后，过表达USP35所降低的脂质ROS和MDA的生成也被影响。 实验：WB检测，LIP检测，Fe2+检测
Erastin为铁死亡诱导剂
干扰FPN后，能够增加LIP和Fe2+的水平，增加ROS和MDA含量；通过CCK8，细胞克隆形成实验以及在体肿瘤检测，发现干扰FPN表达能够促进细胞铁死亡，抑制肿瘤进展； 同时在肺腺癌以及肺鳞癌组织中FPN是高表达的。FPN是USP35调节铁死亡和肿瘤进展的潜在靶点。 实验：WB检测，CCK8检测，细胞克隆形成检测，在体肿瘤检测，LIP检测，Fe2+检测，脂质ROS检测，MDA检测。
RSL3为铁死亡诱导剂
USP35敲低会增加，而过表达USP35降低了泛素化的FPN水平； IP实验证明FPN与内源性USP35能够结合，且通过MG132蛋白酶抑制剂证明了USP35可以直接与FPN相互作用，并作为一种去泛素酶来维持其蛋白的稳定性。
实验：WB检测，IP检测
MG132为蛋白酶抑制剂
铁死亡研究思路借鉴
铁死亡检测方法
1.形态学检测
2.脂质过氧化物检测
3.铁水平检测
4.细胞活力检测
5.线粒体膜电位检测
6.分子水平检测
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1.形态学检测
作为辅助的检测手段，让数据更多维，如电镜检测。
细胞形态特征：铁死亡会导致细胞线粒体萎缩变小，嵴减少甚至消失，膜密度增高，细胞膜断裂和出泡，细胞核形态变化不明显。
2.脂质过氧化物检测（最重要的检测手段）
铁死亡的金指标：脂质过氧化物(Lipid peroxidation)
细胞内活性氧和脂质活性氧通过流式细胞术使用H2DCFDA、C11-BODIPY 和Liperfluo检测。
3.铁水平检测铁离子水平检测
可以借助检测试剂盒，通过比色法和荧光法检测。
4.细胞活力检测
5.线粒体膜电位检测
最常用的探针是JC-1和JC-10，JC-10相对JC-1来说检测效果更好。
6.分子水平检测检测方法
利用Western Blot，PCR等方法检测细胞内相关因子的变化。
关键明星分子：system xc（SLC7A11和SLC3A2），GPX4，转铁蛋白，转铁蛋白受体1
铁死亡检测方法总结
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