细胞焦亡（Pyroptosis）又称细胞炎性坏死，是一种新型的细胞程序性死亡方式。

依赖于 Gasdermin 家族蛋白形成质膜膜孔的可调控的细胞死亡方式，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放而引发炎症反应。

细胞焦亡发生机制

A: 依赖 Caspase-1 的经典途径

Caspase-1 是焦亡过程中最重要的 Caspases 家族成员，通过集结响应不同刺激的炎性传感因子，构建出了专属 Caspase-1 经典通路的因子：NLRP3 炎性体、AIM2 炎性体、NLRP1 炎性体、PYRIN 炎性体，以及 NLRC4 炎性体。

这些炎症小体可介导底物 Gasdermin D (GSDMD) 或炎症因子前体 (如 pro-IL-1β 和 pro-IL-18) 的裂解，打通膜孔道，而这类变化将导致细胞膜破裂，细胞释放炎症因子，引发炎症反应，激发焦亡。

炎症小体是一种多蛋白信号转导复合物，即模式识别受体 PRR，和衔接蛋白 ASC 以及前体 Caspase-1 组成的复合物。 值得注意的是，细胞受到的刺激或应激条件不一样，炎性小体的模式识别受体 PRR 也会不一样。如当前研究最多的虽然是 NLRP3 ，但是在不同外界因素刺激下，影响膜受体的蛋白不只是 NLRP3 起到作用，也包括 NLRC4、NLRP1 、AIM2和PYRIN 。

B: 依赖 Caspase-4/5/11 的非经典途径

Caspase-11/4/5 可以直接识别病原体的脂多糖 (LPS)，从而通过非炎性小体途径激活焦亡过程。当 Caspase-11/4/5 与 LPS 结合时，可直接切割 GSDMD，产生活性 N 末端片段，形成细胞膜孔道，导致焦亡。

C: 活化 Caspase-3/8 ，进而切割 GSDME，引发一种不完全焦亡

Caspase-3/8位于 GSDME 的上游，在焦亡中发挥炎症切割作用。

细胞焦亡研究进展时间线

细胞焦亡的概念最早是在2001年由Cookson和Brennan提出，用于描述炎症细胞中的一种Caspase-1依赖的细胞死亡方式。但很长一段时间内，细胞焦亡的机制一直没有非常重要的进展。

2015年，邵峰院士报道在细胞焦亡过程中会伴随Caspase切割GSDMD的过程，切割后的GSDMD会在细胞膜上形成孔洞，导致IL-1β，IL-18等炎症因子的释放。至此，细胞焦亡的机制才得以研究清楚。

细胞焦亡参与的病程

细胞焦亡广泛参与感染性疾病、代谢性疾病或心血管疾病、神经系统相关疾病、动脉粥样硬化性疾病、肿瘤、肾相关疾病等的发生发展。对细胞焦亡的深入研究有助于认识其在相关疾病发生发展和转归中的作用，为临床防治提供新思路。

细胞焦亡检测方法

1） 细胞焦亡检测--形态学检测

普通光镜

焦亡现象：细胞会出现细胞肿胀，随着时间的变长，肿胀现象会逐渐出现塌陷、变圆。 典型的膜泡状结构（bubbles on the plasma membrane），这是由于细胞膜被穿孔，由于细胞内外渗透压差异，细胞发生肿胀引起。从分子机制上来说，细胞焦亡的发生依赖于gasdermin（GSDMs）家族蛋白在细胞膜上打孔。打孔完成后，成熟的IL-1β和IL-18，还有其它的细胞内容物DAMPs，如 ATP, HMGB1, S100 proteins, and IL-1a 释放出去，有别于细胞凋亡的炎症过程产生。

扫描电镜

扫描电镜是效果最好的形态检测方法。

焦亡现象：细胞肿胀，塌陷，并在细胞膜上观察到很多明显的孔洞。膜孔现象主要是因为GSDMD、GSDME作用。

透射电镜

焦亡现象：透射电镜没有扫描电镜清晰，但是也能观察搭配细胞器丢失，膜上有大量的孔隙。

2）细胞焦亡检测--分子水平检测

检测焦亡相关基因或蛋白的表达水平，检测方法如Western blot、免疫荧光/组化、qpcr等。

关键蛋白：

NLRP3 ASC Pro-caspase-1 Cleaved-caspase-1 Pro-IL-1β Cleaved-IL-1β Pro-IL-18 Cleaved-IL-18 Pro-GSDMD Cleaved-GSDMD β-actin

3）细胞焦亡检测--ELISA

炎性细胞因子IL-1β和IL-18在细胞焦亡中经历caspase-1依赖性激活和分泌。白介素-1β是一种有效的内源性热原，可刺激发热、白细胞组织迁移和多种细胞因子和趋化因子的表达。 白细胞介素-18诱导干扰素γ的产生，对活化T细胞、巨噬细胞和其它细胞类型很重要。白细胞介素-1β和白细胞介素-18在一系列炎症和自身免疫性疾病的发病机制中起着至关重要的作用。

检测指标：IL-1β和IL-18

4）细胞焦亡检测--细胞活力检测

细胞活力检测是检测细胞焦亡的辅助手段，如常用的CCK-8/MTT检测方法。流式也可以对细胞活力进行检测。

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胞焦亡研究思路案例 

细胞焦亡研究思路案例1>>>

Andrade-Oliveira Salvianolic Acid B Modulates Caspase-1–Mediated Pyroptosis in Renal Ischemia Reperfusion Injury via Nrf2 Pathway.

题目四要素主要包括疾病（Renal Ischemia Reperfusion Injury）、表型(Pyroptosis)、主变量分子(Andrade-Oliveira Salvianolic Acid B)、机制(Nrf2 Pathway)四部分内容。

1）现象

SalB治疗可改善缺血再灌注（I/R）引起的肾功能和肾小管病理损伤

实验：肾功能生化检测；HE检测

2）本质

SalB治疗逆转了缺血再灌注肾损伤小鼠焦亡相关基因的表达。实验：WB检测，IHC检测，qPCR检测

SalB缓解H/R引起的细胞凋亡，作用与VX-765（caspase1抑制剂相同），SalB能够抑制caspase1以及ACS表达，且效果与MCC-950（NLRP3抑制剂）类似。

实验：WB检测，IF检测，细胞凋亡检测，细胞活力检测

通过扫描电镜检测可观察到，H/R诱导细胞发生焦亡，细胞塌陷，膜上出现孔洞，细胞肿胀，SalB以及VX-765能够改善H/R引起的细胞焦亡

实验：电镜检测

3）机制

体内模型中，SalB能够抑制I/R引起的NLRP3以及TXNIP表达，并且能够激活Nrf2的核表达，并且通过抑制Keap1的表达，激活HO-1表达。Nrf2/NLRP3信号通路参与了SalB抑制AKI中焦亡的作用。

实验：WB检测；荧光检测

体外细胞模型上，SalB对H/R处理的细胞作用与体内类似。

实验：WB检测；荧光检测；ROS检测

敲低Nrf2后，SalB的抗氧化能力被抑制，且通过GSDMD剪切体的表达可看出，抑制了SalB的抗焦亡能力。

实验：WB检测；荧光检测；ROS检测

细胞焦亡研究思路案例2>>>>

Tumor suppressor DRD2 facilitates M1 macrophages and restricts NF-κB signaling to trigger pyroptosis in breast cancer.

题目四要素主要包括疾病（breast cancer）、表型(Pyroptosis)、主变量分子(Tumor suppressor DRD2)、机制(NF-κB signaling)四部分内容

1）现象

在乳腺癌中，DRD2因为启动子甲基化而表达下降，高表达的DRD2能够促进her2阳性BrCa患者的预后。DRD2是一种潜在的TSG，也是一种很有前途的预测BrCa患者预后的生物标志物。

实验：RNA-seq; IHC；RT-PCR；甲基化特异性PCR检测

DRD2过表达能够抑制乳腺癌细胞的活力，增加其凋亡，抑制其克隆形成能力，抑制迁移侵袭能力，抑制体内成瘤能力。

实验：RT-PCR；WB检测；细胞活力；凋亡检测；细胞周期，划痕，迁移侵袭检测，体内成瘤检测

DRD2过表达抑制乳腺癌细胞的EMT（上皮间质转化）

实验：WB检测，IF检测

在DRD2高表达的乳腺癌组织中，M1型巨噬细胞多，M2型少，DRD2过表达的乳腺癌细胞与巨噬细胞共培养后，能够促进M1型巨噬细胞marker表达，降低M2型巨噬细胞marker水平。

实验：IHC检测；qPCR检测；WB检测；IF检测

2）本质

以下结果表明，DRD2可诱导包括凋亡和坏死在内的程序性细胞死亡(PCD)，这些事件在与Mφ共培养后转化为焦亡。M1以DRD2依赖的方式触发BrCa细胞焦亡。

实验：HE检测；IHC检测，Tunel检测，WB检测

3）机制

DRD2通过阻断其上游激酶TAK1来抑制NF-κB信号通路的激活

实验：WB检测

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