流式死活染料全攻略：死活染料怎么染？流式染色结果如何解读？

科研根号三

2024年12月02日 21:25

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1、流式为什么要染死活染料？

样品中死细胞的存在会极大地影响流式检测效果，从而最终影响数据质量及真实性。

这主要是因为：

死细胞具有非特异性染色。
死细胞自发荧光特别强。最后导致背景荧光增强，使得我们无法观察到一些标记的弱阳性表达。
死细胞还可能会释放DNA，DNA非常粘稠，会导致细胞成团，既影响结果，又容易堵塞管路。

我们常规操作中的，离心、洗涤等步骤就会产生少量死细胞，如果样本本身就是一些细胞活性较差的来源，如非免疫类的组织制备的细胞悬液，病人或长时间放置的血液样本，做细胞培养或模型诱导的体外培养的细胞样本，那细胞活性就更差了，因此推荐大家做流式实验的时候，尽量都不要省去死活染料的搭配。

2、死活染料试剂种类及检测原理

传统的流式细胞死活染料为细胞膜非通透性的核酸染料，例如PI、7-AAD、DAPI。这类核酸染料能穿过死细胞的细胞膜，结合核酸后发出荧光，而无法穿过活细胞的细胞膜。最后染，快速上机。

但是，如果实验涉及到胞内染色，细胞需要固定破膜，核酸染料会将所有的细胞都染上颜色，难以分辨死活信号。此时您应该选择可以固定的细胞死活染料，即Fixable viability dye。先染死活。

3、死活染料的染色流程

①核酸类死活染料：

a.按常规流式染色流程，完成表面染色后；

b.在1×10^6细胞的100 µl细胞悬液中，加入适量核酸类死活染料，轻摇混匀；

（7-AAD（Cat. 556463）: 5 µl, 50 µg/ml；PI（Cat. 556463）: 10 µl, 50 µg /ml；DAPI（Cat. 564907）: 0.5~2 µl, 1 mg/ml；其他染料也请按照说明书推荐用量并结合预实验摸索最佳染料用量）

c.避光室温孵育5 min；

d.1 h内进行流式上机检测。

②胺基类死活染料：

a.使用前，先将染料粉末，请根据说明书中的“Preparation”部分所写的体系，使用细胞培养级别的DMSO，对粉末在室温条件下，进行充分涡旋溶解；

b.使用不含叠氮化钠和不含蛋白质/血清的 Dulbecco 磷酸盐缓冲液(1X DPBS)，清洗细胞一次；

c.在无叠氮化钠和无蛋白质/血清的1X DPBS中以 1-10x10^6 个细胞/ml重悬细胞；

d.每 1 ml 细胞悬液 (1:1000) 加入 1 μl 溶解后的FVS死活染料，涡旋混匀；

（注意：我们建议滴定染料以获得最佳性能，因为不同的细胞类型和不同的应用可能会导致染色的可变性程度很大。）

e.推荐避光室温下孵育 10~15 min（可选：37°C 孵育 5~7 min或 2-8°C 孵育 30~60 min）；

f.用 2 ml BD 的Stain Buffer（Cat. 554656）或替代物（如含1-2%血清的PBS等）洗涤离心收集细胞两次；

g.用Stain Buffer或替代物重悬细胞；

h.根据下游应用的需要，按常规流式染色流程对细胞进行FCR阻断、表面染色、固定破膜及胞内染色等。

4、荧光搭配的选择

死活染料之间的互相之间的区别，除结合原理外，主要就是检测对应的荧光通道不一致，各位老师们可以根据自己仪器的实际情况，选择不冲突的荧光，进行多色搭配即可，详见下表：

5、Fixable Viability Dye流式染色结果如何解读？

相对于未染色的细胞，Fixable Viability Dye染色的细胞整体都会检测到荧光信号，但是可以通过信号的强弱来区分活细胞和死细胞。其中活细胞的细胞膜完整，仅细胞表面蛋白胺基结合了染料，呈现较弱的荧光信号；而死细胞的细胞膜通透性改变，染料能够进入死细胞，与细胞内和细胞表面蛋白上的胺基结合，因此死细胞呈现更强的荧光信号。