简并引物设计，用实例手把手教你设计一对好引物！

南京福麦斯生物

2024年11月20日 11:07

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共10篇

简并引物通俗的讲是不完全相同的引物序列的混合物。使用简并引物是为了增强引物的通用性，即不同DNA序列的目的基因都可以用这种引物进行PCR扩增。其定义是为了获得序列未完全清楚的核酸的一种引物设计方案，特点是所设计的引物序列某位置的核苷酸可以分别是两个或两个以上不同的碱基，结果所合成的引物是该位置上不同序列的混合物。设计原则是把代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列等比例混合。反之，如果为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。

不论特异性引物或简并引物，只要掌握了几个关键点，手动也可以设计出一对好引物。如果不是大批量设计引物或设计复杂的引物序列，下面的四个常用工具即可轻松胜任引物设计任务。

下文以马铃薯 Y 病毒 CP 基因简并引物设计为示例。

【基本原则】

设计一对好的引物，归结起来就是 5′端引物、3′端引物之间以及两者与模板的关系处理得恰到好处：

（1）两引物的序列要与模板的序列紧密互补；

（2）两引物不能在模板的非目的位点发生错配；

（3）两引物之间尽量减少二聚体或发夹结构生成。

【延伸原则】

（1）引物长度：常用为 18-27bp，最大不可超过 38bp，否则容易导致延伸温度过高，不适合 DNA 聚合酶反应；

（2）GC 含量：一般介于 40%-60%之间，且两个引物之间的 GC 含量相差不能过于悬殊；

（3）碱基分布：随机分布最佳，但避免连续的 GC，GC 富集区容易导致错误引发反应。

【特别注意】

5′端引物的作用主要限定 PCR 产物的长度，对扩增特异性影响不大；引物的延伸是从 3′端开始的，所以 3′端引物是影响特异性扩增的最关键因素，因此，在实际设计过程中，设计 3′端引物时，需要综合考虑以下几个内容：

（1）不要终止于密码子的第 3 位

（2）末位碱基避免使用碱基 A

（3）避免出现 3 个以上连续的 G 或 C，如 GCG 或 CCC 或 GGG

（4）ΔG 的绝对值不可超过 9

（5）与非特异扩增的序列同源性不能超过 70%或有连续 8 个互补碱基同源

（6）不能进行任何修饰

【示例背景】

马铃薯 Y 病毒（Potato virus Y, PVY）是侵染马铃薯、烟草、辣椒等茄科作物并造成严重危害的病毒之一，广泛分布全球各马铃薯种植区。RT-PCR 技术具有高度的特异性和灵敏性等特点，已经成为 PVY 检测最常见的方法。但由于 PVY 株系分化严重，不断有新的重组株系产生，单一的特异性引物无法适应 PVY 不同株系的检测需求，需要设计一对简并引物以能够满足生产上的检测需求。

【相关工具】

（1）MEGA5-多重序列比对、选取基因区域、序列编辑

（2）用 MAFFT-多重序列比对

（3）DNAMAN8-检测两引物的互补性

（4）Oligo Calc-评估引物的属性

（5）Web Logo 3-直观显示简并碱基

（6）MAFFT、MEGA和DNAMAN的安装包可以自行下载。

1.序列准备

（1）GenBank 下载 PVY 全基因组序列

（2）由于基因序列比较大，且数量多，推荐用 MAFFT 多重序列比对

（3）扩增片段区域选择，CP 基因长度及位置如下图所示：

先将光标定位在第一条序列任意位置，然后在左下角"Site"处直接输入 CP 基因上游分

界点位置（8391）后回车。接着点击“Speicaes/Abbrv”和 8391 那一列的交界点时按下键盘上“Shift”不放，移动光标到“1”那一列，此时点击鼠标右键“Delete”删除冗余序列。

裁切后得到CP 基因编码区序列，“Export Alignment”导出 CP 基因序列（推荐 fasta 格式）。

2. 引物设计

推荐先设计 3′端引物，至于原因，上面的【特别注意】中已提到，这里不再赘述。

（1）选择引物序列

综合考虑引物设计原则及特别注意，在 CP 基因 3'端位置选取一段合适的序列

（784-803bp），804bp 位置为 A 且是第三个密码子位置，所以弃去末位的 A 碱基。

PS：是否位于密码子的第 3 位，可以通过“Tranlated Protein Sequences”-“DNA sequences”

切换查看，如下图，CP 基因的末端 3 个碱基是终止密码子所在的位置，A 是第三位密码子。

（2）生成 Seq Logo

选定序列后，参考上述步骤，删除冗余序列，保留 CP 基因 3'端序列，同样导出为 Fasta

文件，将序列粘贴入 Web Logo3（http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi）的文本框内或直接上传序列文件，设置相关参数后点击“Create”生成 Seq Logo 格式的文件 CP-3.fas。

参数设置： “Output format”（输出格式）推荐用“PDF”，“Color scheme”（颜色方案）

推荐用“Classic (NA)”，设置完毕，点击右下角“Create Logo“即可得下图的 Seq Logo 格式文件。

通过 Web Logo 生成的多重比对图片可以很直观得到 3'端序列为

CTTGGAGT(C/T/G)AA(G/A)AACATGTG，查询简并碱基代码表（下图），可知 C/T/G=B， G/A=R，简并度=3 ×2 =6，整理后 3′端序列为 CTTGGAGTBAARAACATGTG，故而需要合成的 3′端引物序列：CACATGTTYTTVACTCCAAG（与原序列是反向互补关系）。

3. 质量评估

（1）参数评估

将初步得到的引物序列，粘贴入 Oligo Calc （http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html）的文本框内，按下“Calculate”按钮，得到引物的相关参数，如：长度、GC 含量、Tm 值等信息。

（2）自身互补性（Check Self-Complementarity）

点击“Check Self-Complementarity”，检测引物自身互补性，主要查看“Potential hairpin formation”、“3' Complementarity”、“All potential self-annealing sites are marked in red (allowing

1 mis-match)”下方显示内容，如果三项均为“none“，则说明引物自身不会形成发夹结构且引物自身不会互补，引物没问题！

（3）BLAST 比对回检

点击“Blast”可以对引物进行 BLAST 比对检测，结果显示，都是 PVY CP 基因相关的序列，表明所设计的引物特异性良好。

（4）两引物互补性检查

同样方式，得到 5'端序列：GSAAAYGAYACAATYGATGC，根据引物设计原则，需要检测两引物之间是否存在序列互补。

打开 DNAMAN ，依次在“Primer”-“Load primer”，粘贴任意一端引物序列，如：5'端序列-GSAAAYGAYACAATYGATGC，确定。

接着，在“Primer”-“Two primers Complementarity”-“Second Primer From Input”，粘贴入另一端序列，这里为 3'端引物序列：CACATGTTYTTVACTCCAAG，如下图：

结果显示，两引物间仅有 3 个碱基互补，且自由能仅为 1.8 Kcal/mol。

（5）实验验证

PCR 扩增采用 50μL 反应体系为：10 ×TransTaq HiFi Buffer II 5 μL，2.5nM dNTPs 4 μL， 5′端引物（10 μmol/L）2 μL，3′端引物（10 μmol/L）2 μL，ddH2O 34.75 μL，TransTaq HiFi Polymerase（5 U/μL）0.25 μL，cDNA 2 μL。

PCR 扩增程序条件为：94℃预变性 5min，94℃变性 30s，55℃复性 30s，72℃延伸 1min，共 30 个循环，最后一轮循环后 72℃延伸 10min。反应结束后，1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR

扩增产物，如下图所示：