对于刚接触分子生物学实验的小伙伴们来说，如果做一些与基因相关的实验的话，肯定离不开最基础的实验--PCR。好的引物会让PCR实验成功一半，今天分享如何用Primer Premier 6快速设计引物。同时在本文的第二部分分享了Primer Premier 6的安装，安装包在文末下载。

Primer Premier 6 安装包，在福麦斯生物公众号回复“引物设计”下载！

一、Primer Premier 6 设计引物

1、寻找基因序列

这里我们以“human p53”为例进行引物设计，p53在human中的基因名为TP53。

进入NCBI后，在搜索栏中选择Gene数据库，再输入基因+物种TP53 human，最后点击搜索开始检索。

NCBI网址: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

如下图中所示，此条目为我们所寻找的TP53基因，然后我们点击这个基因条目进入到详细页面。

进入到下一个页面后，在下图中右边蓝色方框圈住的NCBI Reference Sequences (RefSeq)，点击直接跳转到NCBI参考序列（RefSeq）板块。

在mRNA and Protein(s)栏目下，选择“NM 000546.5”点击进入。

页面下滑找到CDS，点击“CDS”点击进入下一页。

选择“FASTA”点击进入。

蓝色方框圈出来为“CDS”。

2、PrimerPremier6设计引物

打开PrimerPremier6，菜单栏File→New→Sequence， 或使用快捷键：Ctrl + E 输入CDS序列，然后点击Add（添加）。

参数设置：Analyze→Primer Search， 或使用快捷键：Ctrl + M

点击“引物参数”，设置熔解温度，设置引物长度，设置扩增产物长度。

可替换引物对，默认是5对。一般出来的引物都是自动按得分高低，所以默认即可。

最后点击“搜索”。

引物序列输出：最好为Best，中等为Good，最差为Poor；一般选择Best或Good。

引物及扩增产物在CDS中的位置，根据设置的参数显示最高得分的引物序列。

点击查看可选择的多对不同引物。

可根据需要选择合适的位置和适当产物长度的引物，选择后点击“替换”。

点击查看当前选定引物的结构。

最后选中引物，右键即可复制所有信息。

二、Primer Premier 6.0 安装（破解版）

本安装教程在win10系统测试可行

下载如下图中Primer Premier 6.0安装包

双击运行Primer Premier 6.0 Install.exe

同意协议后，点击next。

选择安装位置，然后点击Install（安装）

如果需要更改安装位置，安装位置的文件夹命名不能出现中文字。

安装完成之后关掉软件界面。

安装包内有一个crack文件，复制文件内的RMToolkit文件

打开Primer Premier 6.0软件安装目录，软件安装目录就是你在安装软件的时候选择的安装位置。

如果桌面上有Primer Premier的快捷方式，也可以鼠标选中快捷方式，右键选择打开文件所在位置，

如果没有修改安装位置，默认位置为：C:\Program Files (x86)\Primer Premier 6.0。

一路打开文件，到DM600文件，将crack中的RMToolkit粘贴进来，选择替换目标中的文件。

破解完成，打开软件正常使用。

检查下是否破解成功，点击菜单栏help，如果Activate是灰色，就代表破解完成。

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