之前的内容我们讲过了人类免疫细胞T细胞及marker（解读 | 人类免疫细胞T细胞及marker），这篇内容，我们会围绕T细胞流式解决方案展开！
一、活化T细胞因子检测 Th1/Th2/Th17 亚群
Th1/Th2/Th17/Treg 等亚群，最经典的流式检测分群通常都是检测它们分泌的细胞因子来做鉴定分析。
目前研究中用的比较多的是外周血和组织的Th细胞分型评估。
其样本制备流程如下：
在样本制备完成刺激和阻断之后，需要对表面 marker 染色，再通过固定破膜检测胞内细胞因子。
评估过程中注意事项：
① 若为血液样本，制备抗凝血时尽量采用肝素抗凝管，慎用EDTA抗凝管； ② 尽量采用新鲜的活性好的样本，否则活化后细胞因子产量低，信号弱； ③ 人/大鼠样本用 PMA/Ionomycin 处理后 CD4 会被内吞，也可选用 CD8- 来反设 CD4+细胞； ④ 增加 CD69 检测，可确认激活水平是否正常，对无检测信号或检测信号微弱的 troubleshooting 非常关键。
注意：如果要将Treg细胞加入到检测内，Treg细胞特异性指标目前公认的是 CD25和 Foxp3，Foxp3 它位于核内，必须固定破膜后（破核膜）才能检测到，操作步骤较为繁琐。
以下亚群更详细的流式解决方案
Th1细胞>>
对于流式细胞分析，通常使用细胞表面蛋白和细胞内蛋白(例如细胞因子和转录因子)的荧光标志物组合。
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分离出CD4+群体，可以通过使用抗CD3和抗CD28抗体交联共刺激TCR和CD28受体，实现T细胞活化和刺激。除了传统的抗CD3和抗CD28功能性抗体，还可使用抗CD3和抗CD28抗体共价偶联磁珠。Th1的体外分化方案是使用IL-12和IFNγ处理NaiveCD4+T细胞。
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Th2细胞>>
Th2细胞流式分析标志物组合：
CD45+ CD3+ CD4+ IL-4+ CCR4+ CRTH2+(CD8- CD19- CCR6- CXCR5- CXCR3- CCR10-)
Th2细胞的分化：
Th2细胞是由IL-4和IL-2特异性活化。IL-4刺激促进STAT磷酸化以及GATA3上调，GATA3是Th2细胞发育的关键转录因子。GATA3与IL-2诱导的STAT5信号转导相互作用，上调IL-4表达。紧接着是IL-4驱动的正反馈机制，即持续的IL-4-STAT6-GATA3和IL-5-STAT5信号转导不断的让Th2扩增。GATA3的IL-4依赖性STAT6活化是Th2细胞分化的经典途径。此外，有许多非经典途径被认为对Th2分化很重要，包括多种转录因子(如c-Maf，NF-κB，IRF4，AP1)和细胞因子(如胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)，IL-5，IL-25和IL-33)。
Th17细胞>>
Th17细胞流式分析标志物组合：
对Th17细胞的分型通常依赖于关键效应细胞因子IL-17A或转录主要调节因子RORγt的细胞内染色，以及CD4表面表标志物，即CD4+IL-17+IFNγ-。另外，CCR6是趋化因子受体，在响应CCL20时驱动细胞迁移，由Th17细胞表达，但是CD4+CCR6+种群存在异质性，Th22也能表达。在对IL-17胞内染色之前，需用PMA、离子霉素和高尔基体阻断剂处理细胞。
Th17细胞的分化：
Th17细胞的诱导分化因子主要是IL-1β和IL-6，前者参与早期Th17分化，上调RORγt和IRF4，维持Th17细胞因子表达谱，后者诱导STAT3信号转导，对RORγt和IL-21的活化至关重要。此外还有IL-21和IL-23，前者促进自分泌STAT3信号转导，上调IL-23R，后者降低可塑性和去分化的潜力，诱导特征性Th17细胞因子高表达。必要时可以加入抗IL-2、抗IFNγ或抗IL-4以阻止向其他谱系(如Th1/Th2)分化，防止Th17分化抑制。
调节性T细胞>>
Treg的分类和命名已经标准化，包括三个主要的Treg种群：
胸腺衍生的Treg(tTreg)，此前被称为天然Treg。
外周Treg(pTreg)是由抗原刺激诱导外周淋巴组织(如肠道相关淋巴组织)中的naïveT细胞而来。
体外诱导的Treg(iTreg)则来源于在IL-2和转化生长因子β存在下用抗CD3刺激naiveCD4+ T细胞。
没有独特的标志物能完全区分这三个亚群。
Treg细胞流式分析标志物以及诱导分化因子:
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流式分选Treg时，根据CD45RA和FoxP3表达强度区分的三群Treg细胞(CD4+CD45RA+FoxP3lowT、CD4+CD45RA-FoxP3highT和CD4+CD45RA-FoxP3lowT细胞)可以分别以分选CD45RA+CD25+(Fr.I)、CD45RA-CD25++(Fr.II)和CD45RA-CD25+(Fr.III)T细胞代替。
滤泡辅助T细胞>>
滤泡辅助T细胞(Tfh)是参与体液应答的CD4阳性辅助性T细胞的一个亚群。Tfh细胞存在于次级淋巴组织中，包括扁桃体、脾脏和淋巴结。Tfh细胞的作用是触发生化中心(GC)B细胞分化成分泌抗体的浆细胞和记忆性B细胞。
Tfh细胞是CD4+细胞，其可表达高水平的趋化因子受体5蛋白和转录因子B细胞淋巴瘤6，即CD4+CXCR5+BCL6+，其他的标志物包括表面标志CXCR3、ICOS、PD1和细胞因子IL-21。
一般认为，Tfh的分化需要在IL-6和IL-21同时存在的情况下，用MHCII特异性多肽刺激naiveCD4+T细胞TCR。
细胞毒性T细胞>>
人CD8+T细胞不同亚群的细胞标志物：
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小鼠CD8+T细胞亚群的标志物：
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效应性CD8+T细胞表型和功能：
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CD8+T细胞的活化和分化
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CD8+T细胞介导的细胞毒性主要通过穿孔素、颗粒酶B、Fas-FasL途径和TNFα、IFNγ实现，因此，通过流式检测这些分子可以评价CTL的功能。
在体外多克隆活化CD8+T细胞，可以使用naiveCD8+T细胞3~4天，能实现T细胞扩增和活化，在体外诱导CD3/CD28介导的T细胞活化。激活后的细胞可以进一步与细胞因子和感兴趣的化合物一起培养，以进行分化和细胞因子分析。此外，应在细胞培养基中加入IL-2，以维持CD8+T细胞。
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Human T-activatorDynabeads通过模拟树突状细胞在体外诱导CD3/CD28介导的T细胞活化。
多色方案检测人类和非人类灵长类动物抗原特异性T细胞：
Nogimori T, Moriishi E, Ikeda M, Takahama S, Yamamoto T. OMIP 075: A 22-color panel for the measurement of antigen-specific T-cell responses in human and nonhuman primates. Cytometry A. 2021 Sep;99(9):884-887. doi: 10.1002/cyto.a.24460. Epub 2021 May 27. PMID: 34042267.
二、Th/Treg 细胞极化及检测
分离Naive CD4+，用 CD3/CD28 磁珠进行活化，IL-2 协助增殖。通过不同的细胞因子加入功能性的抗体阻断其它谱系的分化。
不同亚群相关细胞因子推荐：
Th1：IL-12、IFN-r、IL-16、IL-27、Anti IL-4； Th2：IL-4、IL-6、IL-31、IL-23、IL-25、Anti IL-12、Anti IFN-r； Th17：TGF-b、IL-1b、IL-6、IL-23、IL-21、Anti IL-12、Anti IL-4、Anti IFN-r； i Treg：IL-2、TGF-b、IL-10；
Treg的获取方式：
🔹 用极化的方式诱导Treg；
🔹通过流式分选/磁分选对Treg进行分离和纯化（磁珠分选CD4+CD25+RegulatoryTCell Isolation Kit II）；
值得一提的是，Human 中 CD127 代替 Foxp3 已被广泛认可，早在2006年，就有文章指出在人样本中 CD127 的表达与 Foxp3 的 CD4+ Treg 细胞表达呈负相关。且相较于 Foxp3，CD127 是表面指标，不需要固定破膜就可以检测到，在检测Treg细胞上更方便。在临床上，CD127 也被用于替换 Foxp3 去检测Treg细胞。
相关文献推荐：
用Naive CD4+极化不同的CD4+亚群进行检测（DOI: 10.1093/nar/gkv752）
DOI: 10.1093/nar/gkv752
Th/Treg制备相关产品推荐：
三、表面染色检测CD4+T细胞亚群
Th1/Th2/Th17/Treg 等亚群，最经典的流式检测分群通常都是检测它们分泌的细胞因子来做鉴定分析，但是细胞因子位于细胞膜内，需要固定破膜才可以检测得到；其次细胞因子在细胞静息期或者轻度炎症下分泌量非常微小，很难检测到，需要额外对细胞进行体外刺激和因子分泌阻断处理来提高检出率；另外细胞因子往往很不稳定，容易受外界处理不当而降解，如样本数量过大，样本制备活性不好，或不适当的固定破膜试剂等影响。
因此很多科学家会为了简化Th亚群的检测难度，使用对应细胞亚群的表面标志物或核内标志物进行检测。尤其是涉及 marker 多的情况下，更建议用表面染色检测CD4+T细胞亚群。
OMIP 系列多色流式文章推荐：Cytometry Part A 是一本定量单细胞分析杂志，以采用定量单细胞测量、分离、操作和建模技术的创新科学研究的原始研究报告和综述为特色。
Cytometry Part A 上发表的 Optimized Multicolor Immunofluorescence Panel (OMIP) 系列文章，是经过同行评审的，旨在报道用于流式细胞术、荧光显微镜、成像细胞术和其他基于多色荧光的方法的新设计和优化的多色面板。
文献推荐：OMIP-042: 21-color flow cytometry to comprehensively immunophenotype major lymphocyte and myeloid subsets in human peripheral blood.
基于 21 色流式细胞仪的 OMIP 1 能够同时定量人外周血中的单核细胞、嗜碱性粒细胞、粒细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、B细胞以及所有明确定义的T细胞和T辅助细胞亚群(表1)。此面板捕获了NIH人类免疫学项目 2,3 中描述的主要表型，并附加了用于深度T细胞分析的标记4。
Reagents for OMIP-042：
圈门逻辑：
这篇文章内几乎涵盖了目前被认可的Th细胞亚群。如 Th1、Th2、Th17、Treg，这里都是用表面 marker 进行鉴定，如这里的Treg鉴定用的就是 CD127 代替 Foxp3。详见如下汇总表：
Optimized Multicolor Immunofluorescence Panel (OMIP) 系列文章除了关注正文部分，也建议关注相应佐证材料（Supporting information）。
如以下佐证材料，展示了对于每一个 marker 用到的克隆都是经过了详细的筛选，包括所搭配的荧光色；Supporting information 内的 Panel Development 和Staining Protocol 也有详细的介绍。
如以下佐证材料，详细介绍了圈门逻辑。
DOI：10.1002/cyto.a.23303
四、T细胞增殖评估 or Treg功能评估
利用流式技术评估T细胞增殖 or Treg功能，bio-protocol 上这一篇文献的实验流程以及注意事项都非常详细，可以作为参考，这里就不再赘述。
DOI: 10.21769/BioProtoc.1010305
五、T细胞杀伤功能评估
研究T细胞对靶细胞的杀伤功能的方法有多种：
①对靶细胞进行改造后用荧光法和多色流式细胞术进行评估（经济实用）；
②逐渐被认可的 RTCA生物传感器检测；
③流式细胞仪细胞溶解分析（增殖染料和死活染料的联用）；
④基于流式衍生出的方法，通过对磁珠结合相应的细胞毒性T细胞在杀伤靶细胞时分泌的毒性细胞因子进行评估，如 luminex、multiplex、CBA 等方法。
DOI: 10.1016/j.jim.2020.112899
六、T细胞毒性潜能评估
T细胞的杀伤力不依赖靶细胞也可以进行评估，主要针对细胞毒性T细胞在杀伤靶细胞自身发生的变化进行评估。
比较经典的方法是细胞毒性T细胞在和靶细胞接触的过程中，通过免疫突触发生脱颗粒的作用。颗粒物质在细胞毒性T细胞内都会产生囊泡状的物质，会包含很多毒性颗粒，包括传统性的杀伤因子 Perforin、Granzymes、Granulysin、Proteoglycan，会包裹在毒性颗粒内。同时这些颗粒物质还会包括颗粒的溶酶体膜成分 CD107a、CD107b、CD63，这些都是溶酶体相关的膜蛋白，它们在脱颗粒的过程中会从溶酶体脱落出来，形成转运的膜泡，膜泡会从细胞毒性T细胞释放到靶细胞内发挥融靶细胞的能力。
通过表面染色的方式检测 CD107a/CD107b 的水平，从而评估效应细胞的毒性潜能，也可以通过颗粒物质释放的水平评估细胞的毒性潜能。
通过干扰素γ、穿孔素颗粒酶评估效应细胞的毒性潜能。
通过表面染色 CD107a 进行评估细胞的毒性潜能。
七、流式检测应用-Signaling pathway
JAK-STAT 通路调控肿瘤免疫
在研究T细胞中更多的是结合肿瘤免疫进行研究。T细胞在肿瘤免疫中涉及多种T细胞，这些T细胞和肿瘤发挥免疫功能的时候会涉及到信号通路的变化，如 JAK-STAT 信号通路，SMART 信号通路，都会有活化水平的改变。
研究信号通路中关键蛋白的磷酸化以往都是用WB评估研究，但是WB存在一定的弊端：WB仅能检测总裂解物中平均蛋白含量变化，对某一细胞群体易产生误判。相比之下流式检测信号通路中关键蛋白的磷酸化较传统WB法更合理便捷。
如下图所示：流式分析和WB分析的差异
(A)在这个假设的实验中，获得了三个样品，它们含有一种感兴趣的蛋白质在1,10，每个单元格10份或50份，如所示。每个细胞的蛋白质分子平均数为1，样本2和样本3均为5。 (B)当通过 Western印迹分析这些细胞群时，样品2和3将显示较暗的条带，但彼此看起来相同。 (C)然而，当用荧光标记的抗体对样品进行蛋白质染色并通过流式细胞仪进行分析时，可以清楚地看到样品2包含两个不同群体的细胞，这两个群体具有相同的代表性，而在样品3中，只有大约1/10的细胞具有较高的蛋白质水平。样品中的这种异质性可能是由于不同的细胞类型(即免疫细胞)，或者是由于全或无类型的信号反应。
磷酸特异性流式细胞仪的多维分析。
DOI: 10.1016/j.clim.2003.11.009
流式在CAR-T研究中的应用
CAR-T细胞的生产研发、临床治疗每个环节都与流式检测密不可分。在其它T细胞相关研究中需要应用到的流式方法，CAR-T细胞研究中基本都有涉及。
1. CAR阳性率鉴定
2. T细胞活化鉴定
3. 细胞均一性及纯度评估
4. CAR-T细胞亚群分析
5. CAR-T细胞增殖及细胞存活率评估
6. CAR-T生物学效力评估
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