Western blot 是显示蛋白丰度相对变化的半定量方法，通过分析信号强度，可以确定样本中目标蛋白的表达量相对于其它样本（如对照组、模型组）是增加还是减少。将目标蛋白条带发出的信号使用软件进行分析，计算出目标蛋白的相对定量值，即为 WB 定量。 对 WB 条带进行定量方法之一是灰度分析，灰度是计算机图像分析仪根据图像颜色深浅分为 256 个级别。灰度值越小物体颜色越深。
常用的蛋白灰度分析软件有 Image-Pro Plus ，Quantity One ，Image J/fiji；还有不太常用的还有 Gel-Pro Analyzer、Image Lab 等。所有 WB 条带灰度分析工具的安装包都可以在文末下载
一、常用的蛋白灰度分析工具
1）Image-Pro Plus
与我们耳熟能详的 image J 不同，image-Pro plus 是一个付费使用的软件。
Image-Pro Plus 综合性能最好，操作简便结果可靠。因为它有强大的 IOD 算法，能准确反应蛋白灰度。但需要靠魔棒或轨迹法选取目的蛋白区域，有一定的主观性，不过蛋白灰度测定本身就是半定量分析（也就是说测量值本身就没有一定标准）。
剔除背景调整参数之后，有 2 种方法选择目的蛋白区域：魔棒和手绘轨迹法
①魔棒：首选方法，客观科学，适合于蛋白条带轮廓清楚且各蛋白条带不融合（若条带弥散，相互融合，则魔棒无法选择单一蛋白条带，这时就要用手绘通过肉眼选择目的蛋白区域）。
②手绘轨迹法：主观性较强，当魔棒无法选择单一条带时才使用。
2）Quantity One
Biorad 公司的 Quantiy One 软件，付费软件。其最大的优点莫过于自动识别条带代替人工分析以降低主观误差，同时它的很多功能渗透了艰深的数理理论以及概率统计的原理。
有泳道-轨迹测定法，等高线/手绘选取目的区域测定法等方法。
①泳道-轨迹测定法
先剔除一系列背景，再选择泳道（lane），然后分析条带（band），最后使用高斯建模得出灰度分析值（Gauss Model trace）。它最大优点在于可以完全抛弃人为主观因素进行全自动定量，比较科学。重复性好，但这种方法使用起来步骤较为繁琐。
②等高线-手绘选取目的区域测定法
通过半自动描绘电泳条带的等高线边缘来得到等高线区域内部面积，再将该面积乘以区域内平均光密度值得到条带内部总的信号量。这个方法最简便，但重复性不太好，且等高线的绘制处于“半自动”状态，即需要人为判断作为等高线标准的电泳条带的边缘。
3）Image J & fiji（ fiji is just ImageJ）
Image J 这款工具胜在免费，基于强大的图片分析与处理功能，Image J 在科研中的应用极为广泛。（使用广泛也就意味着很多人都在用，遇到问题可以更快的找到解答）。 Image J 做蛋白灰度分析的步骤操作简单，容易上手。先转化灰度图以及去除背景影响，然后设置参数与单位，转化为亮带之后，利用选择工具选中分析的单个条带分析，之后逐一选取分析即可。
之前分享过 Image J 蛋白灰度分析详细的操作步骤，需要学习的可以看以下文章↓↓↓
fiji 是 ImageJ 的版本之一，全称为 fiji is just ImageJ，也是免费工具。fiji 就是预装了很多生物医学分析常用插件的ImageJ。
Fiji 做蛋白灰度分析的步骤和 Image J 一致，这里不再赘述。
二、关于蛋白灰度分析的相关知识点
1）光密度与灰度
光密度：吸收光的物质的光学密度。（optical density,就是常说的 OD 值）光密度值是直接与染色物质的量相关的。 灰度：灰是不够黑，是反射亮度的单位。电子照片上像素的亮度称为灰度。灰度是计算机图像分析仪根据图像颜色深浅分为 256个 级别。灰度值越小物体颜色越深。
2）关于OD值
OD 值是一个没有单位的相对值。使用酶标仪或分光光度计时要作标准曲线。对电泳条带进行定量分析时一样要作标准曲线。 电泳条带照片的灰度值与样品量的关系为指数函数。在把灰度值转换成 OD 值时，用一个标准点进行定量分析是不准确的。多个标准点的标准曲线亦有很大误差，因此只能说是半定量分析。
3）吸光物质的光学密度
被测物质的量越多，光密度（OD 值）越高，透射出的光越少，反映在照片上就越黑。 OD 值与物质的量直接相关，数字图象上点的灰度值与对应物质 OD 值成对数关系，符合朗伯-比尔定律。
不同软件测量值不同，即使相同软件重复测量数值也不一定相同，因此只要测定数值能反应目的蛋白变化趋势，测量值相对偏差不大即可。不同的软件各有千秋，大家可以综合考虑再做选择。
三、软件下载
老规矩，关注福麦斯生物公众号，回复红色关键词即可领取
1）Gel-Pro analyzer 4+quantity one 4.6.2+image lab 3.0安装包：回复关键词【软件318】；
2）Image J+Fiji+image pro plus安装包：回复关键词【软件119】
这3个软件对比以及安装教程可以看之前发过的文章↓↓↓
顶级图像分析工具，ImageJ、Fiji、Image pro plus，选这3款准没错！
其他软件下载，也可以扫描上方福麦斯生物的二维码，回复红色关键词即可领取
1）科研人必备23个软件安装包（文献管理+科研绘图+写作翻译+统计分析+办公常用）：回复关键词【软件916】； 2）《实验protocol大全》 ：回复关键词【实验098】； 3）生物实验必看之《实验室保命指南》 ：回复关键词【实验903】； 4）2021年-2023年国自然生命科学部和医学科学部的立项清单+超过1000份往年经典中标标书：回复关键词【基金必中】； 5）ScienceSlides插件安装包：回复关键词【绘图830】； 6）80本科研电子书（高清版PDF）：回复关键词【资料1011】； 7）中文核心（北大核心）期刊、科技核心期刊、CSCD期刊最新期刊目录：回复关键词【投稿116】； 8）Image J+Fiji+image pro plus安装包：回复关键词【软件119】 ； 9）Acrobat Pro DC：回复关键词【软件915】； 10）Stylewriter：回复关键词【翻译121】 ； 11）Pathway Builder Tool：回复关键词【绘图1124】； 12）引物设计四剑客 自动搜索&分析评价全搞定！Primer Premier 5/Primer Premier 6/Oligo 6 /Oligo 7 ：回复关键词【资源1117】 ； 13）WhiteSmoke安装包：回复关键词【软件016】； 14）细胞自噬相关研究资料打包分享：回复关键词【实验204】 15）Zlibrary客户端下载：回复关键词【工具226】 ； 16）常用的CD分子汇总表格：回复关键词【实验229】 ； 17）Windows EndNote X9安装包：回复关键词【软件314】 ；
18）Gel-Pro analyzer 4+quantity one 4.6.2+image lab 3.0安装包：回复关键词【软件318】。
