我想带你经历一下无意义介导衰变的发现过程会很有趣。 所以这实际上是从麻省理工学院大卫·豪斯曼实验室的工作开始的，他在那里研究β-地中海贫血-- 在这种情况下，这些是导致β珠蛋白丢失的遗传性疾病，而α地中海贫血则是α珠蛋白（α珠蛋白).

他和其他机构的同事们注意到，当出现β-地中海贫血时，你不仅没有制造出α-β-O地中海贫血蛋白，而是一种不制造β-珠蛋白和蛋白质的突变体。但你也没有制造RNA。

这是令人困惑的，因为他们没有根据各种分析认为这些是删除。他们认为有某种点突变。因此，当你有点突变时，为什么你不能产生mRNA，这很令人困惑。如果编码序列只有一两个变化，它怎么知道它不是正确的mRNA？所以他们继续研究，尤其是这个。

几年后，苏珊·伯瑟加和爱德华·本茨。这是在1988年。实际上，在两者之间，这是1978年。这次和这次的最大区别是他们可以对基因进行测序。他们也许能做点什么。但到目前为止，每个人都可以对自己的基因进行测序。

所以他们得到了这些基因的所有编码区。他们发现，如果有点突变导致了像这样的终止密码子，那么UAG与该位点的正常序列相反。 这是rRNA水平。如果你有UAG或UAA停止密码子，你会看到这种戏剧性的下降。

但如果你有GAG，你就看不到。他们一直看到的是，如果他们有一个非野生型终止密码子，你显然看到了蛋白质片段，但你也看到了mRNA水平大大下降。

所以这是无意义介导衰变的第一个线索。随后，他们发现这需要翻译。如果你真的用环己酰亚胺（又称放线菌酮）处理细胞， 这是一个野生型基因，B、C和D是三种不同的突变体，它们含有过早终止密码子，所以我将使用这个术语PTC。

观察到的是，如果你没有提前终止密码子，并且你停止了翻译，那么mRNA就很简单了，就像正常情况下一样稳定。

但如果你有过早的蛋白密码子，你就会显著稳定RNA。所以你可以看到这里有环己酰亚胺，这里没有……没有，有，没有，有。 因此，在这些条件下，你可能会导致mRNA的这种主要稳定。

因此，在这一点上，非常清楚的是，如果存在过早终止密码子，则存在翻译依赖性机制来驱动mRNA的丢失。然后他们变得聪明了。他们绘制了剪接位点图，他们发现剪接在某种程度上参与了其中。

现在，关于拼接，有一件事很有趣，那就是在大多数情况下，我确信有例外，但在大多数情况中，最后一个内含子与编码区重叠。很少有，如果有的话，内含子只在3'UTR中。因此，这可能是上游的事情。 甚至在5’UTR中偶尔会出现一些情况，但你看不到拼接点或拼接点——我很少这么说。 我肯定有例外。在3'UTR-非翻译区。 所以他们不知道有这么一个全局性的事实，就像我们现在所做的那样，但内含子的一个非常普遍的特征是，它们要么在基因的上游，要么在基因编码区内。

这两个小组以两种不同的方式发现的是，如果你消除了一个位于过早终止密码子下游的剪接连接，你就会显著稳定RNA。

所以在终止密码子下游有一个内含子对mRNA的衰变有积极的影响。然后这些人表明，只有当上游基本上超过50到55个碱基对时，这才有效。 所以如果你有一个过早的终止密码子，并且它在剪接连接上游只有35个碱基对，即外显子和内含子之间的边界，那么你失去了这种衰变，你就有了环己酰亚胺。所以挠挠你的头。

这是什么意思？所以这表明——因为这一切都在进行，衰变发生在细胞质中。但剪接发生在细胞核中。因此，剪接过程以某种方式直接影响衰变的机制没有多大意义。

因为我们知道它（RNA降解）必须发生在细胞质中，因为它依赖于翻译。同样，翻译只在细胞质中进行。因此，这是一种被称为外显子连接复合物的发现所提供的信息。 事实证明，所有这些复合物都起作用——这些RNP在剪接过程中起作用——当它们完成后，它们会在RNA上留下一组蛋白质。他们把它留在每个形成外显子-外显子连接的地方。这就是，无论他们在哪里拿出内含子，都会留下一块小饼干（小痕迹）。它被称为外显子连接复合体，是通过这种方法发现的。

所以他们做了什么——我认为这是一个非常聪明的方法，他们制造了mRNA，所以这是上游外显子，这是下游外显子。他们将一个光敏基团和一个放射性磷酸盐放在已经剪接的mRNA的连接处的右侧，或者将其放在外显子-内含子上游边界上，作为交叉接头，他们将放射性核苷酸放在这个前mRNA的内含子-外显子下游边界上，他们还没有被剪接。

现在，如果它是拼接的，它最终会看起来像这样。 因此，一个正确拼接的分子将是这个分子的双胞胎。

顺便说一句，这都是在HeLa提取物中完成的。原来你可以做拼接一 有人知道HeLa细胞是什么吗？ 亨丽埃塔·拉克斯的永生？所以这可能是最流行的组织培养细胞。它像杂草一样生长，几十年来人们一直用它在真核细胞中进行基础生物化学研究。因此，当他们发现剪接时，他们首先要做的事情之一是建立一个体外系统来进行剪接，结果是这些体外HeLa细胞提取物。他们选择这样做的原因是，你可以培养一升又一升的这些细胞，以及许多其他组织培养细胞，我们很难做到这一点。因此，如果你想要大量的起始材料来提取提取物，那是一个很好的开始。

我要指出的是，在你交叉连接这些基因后，你可以用核糖核酸酶轻处理它们，或者你根本不能这样做。结果表明，在SDS-PAGE凝胶中运行的核酸对蛋白质的迁移速率几乎没有影响。 这基本上是因为它们不能很好地结合SDS。SDS与蛋白质在其长度上的结合提供了一种相对均匀的电荷-长度分布，当其通过筛选时，将根据其分子量区分蛋白质。

但当他们使用mRNA时，他们没有看到许多蛋白质被交联。但如果你允许剪接发生在摘录中，那么你就得到了所有这些事情的发生。

这不可能是序列特异性RNA结合，因为如果这就是你在这里看到的全部。

它不可能与这家伙结合，因为当你进行这种光核酸酶处理时，交联剂离放射性核苷酸太远，无法彼此分离。 你不必这样做。但出于他们的目的，他们想摆脱这个，除非它紧邻它。 这说明有一堆蛋白质已经被鉴定出来了，我不打算详细介绍它们，但它们已经被留下了。结果发现，它们在外显子-外显子连接处上游约有25个核苷酸。