双gRNA载体应用于大片段基因敲除，定制服务

一、双 gRNA 载体在基因编辑中的原理

双 gRNA 载体是基因编辑技术中的一种有效工具，在大片段基因敲除中具有独特优势。在 CRISPR - Cas9 系统基础上，双 gRNA 载体设计包含两个引导 RNA（gRNA），它们分别引导 Cas9 蛋白识别目标基因大片段两端的特定序列。当 Cas9 在两个 gRNA 的引导下，在大片段基因的两端分别制造双链断裂（DSB），这会引发细胞内的修复机制，进而实现大片段基因的敲除。

二、双 gRNA 载体设计要点

（一）gRNA 选择

特异性：对于每个 gRNA，要确保其具有高度特异性，仅识别目标基因大片段两端的序列，避免与基因组中其他非目标基因序列发生结合。通过生物信息学工具对潜在的脱靶位点进行严格分析和筛选，以降低脱靶效应。

效率：选择在目标基因上具有较高编辑效率的 gRNA 序列。这可以通过参考已有的基因编辑数据库或在预实验中对多个候选 gRNA 进行测试来确定。

位置选择：两个 gRNA 应分别靶向大片段基因的两端合适位置。一般选择在基因的外显子 - 内含子边界附近或关键功能结构域两侧等，这样可以更有效地破坏基因的完整性，确保大片段基因在修复过程中被完整去除。

（二）载体构建

构建双 gRNA 载体时，要保证两个 gRNA 的表达在细胞内受到合适的调控。可以将两个 gRNA 的编码序列构建在同一个载体上，通过合适的启动子和调控元件来控制它们的表达水平和时间。同时，要确保载体能够稳定地转染目标细胞，并在细胞内有效地发挥作用。

三、大片段基因敲除的机制与过程

（一）双链断裂引发修复

当双 gRNA 引导 Cas9 在大片段基因两端制造 DSB 后，细胞内的修复机制启动。主要有两种修复途径：同源定向修复（HDR）和非同源末端连接（NHEJ）。在大片段基因敲除中，通常是 NHEJ 发挥主要作用。由于两个 DSB 位点距离较远，细胞在修复过程中无法准确地将两端重新连接，从而导致大片段基因的缺失。

（二）细胞类型对敲除效果的影响

不同类型的细胞其修复能力和偏好有所不同。例如，某些干细胞可能具有较高的 HDR 活性，而在一些分化成熟的细胞中，NHEJ 可能占主导。因此，在使用双 gRNA 载体进行大片段基因敲除时，需要考虑目标细胞的类型，可能需要针对不同细胞类型优化实验条件，以提高敲除效率。

产品：

慢病毒介导的shRNA靶向干扰基因表达

大鼠基因RNA干扰慢病毒载体的构建

靶向PRL-3基因的shRNA慢病毒载体的构建

构建慢病毒载体

慢病毒载体质粒

慢病毒载体的骨架质粒合成

构建表达载体(过表达,敲除或者敲低)

基因敲减慢病毒载体感染细胞株

慢病毒制备和导入细胞

慢病毒及稳转细胞构建

RNAi基因敲减细胞系构建服务

MicroRNA抑制表达稳转细胞系构建服务

构建慢病毒表达载体

齐岳小编axc