近年来，动物和人类单细胞转录组的研究日益成熟，而植物单细胞转录组的大规模研究和应用还有待进一步提升。植物各个组织中单个细胞协同作用赋予植物组织不同的功能。单细胞测序技术应用于植物，有助于揭示植物发育和胁迫适应所涉及的基本细胞活动。

对于植物来说，单细胞实验在收集细胞之前，需要通过酶消化去除细胞壁。而植物原生质体制备存在以下几个难点：

①植物细胞被固定在刚性细胞壁基质中，分离单细胞时需要将其移除；

②植物细胞壁的酶消化是一种重要的胁迫源，容易刺激植物细胞出现应激反应，诱导压力应答基因的表达，人为引入转录偏差；

③植物原生质体大小存在可变性（渗透压的差异都会导致原生质体破裂）；

④质体细胞器、和液泡中存在可与RNA相互作用的次级代谢物；

⑤不同组织类型间适用的酶组合不同，需要优化消化细胞壁所需的酶；

⑥制备的原生质体很脆弱，活性波动大。

⑦制备原生质体过程中会产生大量杂质，在去杂过程中原生质体易破裂。

因此，一种无需原生质体制备的方法急需出现来打破上述壁垒——提取植物细胞核。

·实验步骤·

实验步骤分为细胞核分离、纯化和提高核膜通透性。细胞核分离步骤：在NIB培养基中磨碎植物样品，过滤得到细胞核；纯化：利用孔径更小的滤膜过滤掉杂质或利用流式细胞仪进一步纯化细胞核；提高核膜通透性：通过加入Triton X-100提高核膜的通透性，便于后续Tn5转座酶进入细胞核。最后，利用10× Genomics提供的缓冲液重悬细胞核至合适的密度，进入后续的测序建库步骤。

单核ATAC-SEQ文库构建兼容的核分离、纯化和渗透工作流程

一、植物细胞核分离

采集植物样本前30分钟，将所有材料和试剂冷却至4℃(即培养皿、手术刀片、枪头、锥形管、细胞滤膜)。在整个过程中将样品和分离的细胞核保持在4℃，以降低应力水平并最大限度地保持核膜的完整性。

1、收集100~1000 mg的新鲜植物样本，将其放入60 mm培养皿中，加入500μL预冷的NIB培养基。

2、用手术刀片在NIB培养基中切碎植物组织约30 s。用预冷的NIB培养基浸没切碎的植物组织，以保持样品的湿润(平均每克切碎的植物组织需要1 mL的NIB培养基)，避免使用过量的NIB培养基，因为这会使样品切碎变得困难。

3、将植物组织再切细4min(即切碎的样本应容易用1m大口径尖端枪头吸起)

4、用500μL的预冷NIB培养基预润湿40μm滤膜。

5、使用移液枪将核-NIB混合物轻轻转移到滤膜顶部。在60 mm培养皿中加入1 mL预冷的NIB，洗涤并收集剩余的细胞核。用1 mL大口径移液枪轻轻地将此体积转移到40μm滤膜中。

二、植物细胞核纯化

非荧光激活的细胞核分选(FANS)纯化——细胞核直径小于30μm

1.用500μL的预冷NIB培养基预润湿30μm滤膜。

2. 使用1mL大口径移液枪，将从步骤A7过滤的核-NIB培养基混合物轻轻转移到30μm滤膜上。

3. 在显微镜下执行第一次核质量检查；检查是否有碎片污染：

a. 将装有核混合物的50 mL锥形管和10 μl吸管轻轻旋转到微型载玻片上。加入最终浓度为0.5μm的SYTOX Green DNA染色，用盖玻片盖住微型载玻片。观察荧光显微镜，寻找细胞核悬浮液中细胞碎片的潜在污染。

4. 要清除剩余的碎片，使用另一个30μm或20μm滤膜过滤细胞核再悬浮。在确认分离的细胞核的质量和纯度后，进行细胞核的渗透稳定。

用20µm细胞滤膜纯化前(A)和纯化后(B的)植物细胞核显微图片

荧光激活的细胞核分选(FANS)纯化

1、设置单元格分类器。

a. 使用100µm喷嘴和20磅/平方英寸的默认系统压力，以最大限度地减少分选过程中对细胞核的应力。在分拣前和分拣过程中，将样品和采集室冷却至4 °C。

2、 转移和分选200 µL未染色的细胞核，建立细胞核分选的基线。

3、 在细胞核悬浮液中按v/v 1：40的比例加入7-AAD(即每1 mL细胞核混合物加入25 μL的7-AAD)。在分选之前，在冰上孵化至少30 min。注：到目前为止，7-AAD是唯一通过10x Genomes验证可以进行单细胞核ATAC-seq实验的染料。根据10X Genomes 研究，7-ADD不会干扰Tn5转座酶活性。

4、 使用BD FACSAria II细胞分类器或具有类似光谱特性的细胞分类器对样品进行分类。

a. 用561 nm激光激发7-AAD信号，使用635长通(LP)滤波器和660/20带通(BP)滤波器的组合检测其发射。

b. 在正向与侧向散射(FSC与SSC)上显示和选通初始信号，以去除不需要的非核事件和碎片。随后，在7-AAD高度(7-AAD-H)与7-AAD宽度(7-AAD-W)曲线图上显示数据，以允许去除额外污染物。

c. 对于难以区分的7-AAD染色的细胞核和自发荧光细胞器，使用显示7-AAD和相邻荧光的双变量图的方法(即488 nm激发激光和600LP和610/20bp的滤膜组)，此方法能够更好地区分样品和细胞器的7-AAD阳性细胞核部分。在这种结构中，细胞核部分稍微远离细胞器，使得染色的细胞核能够被门控和分选。

5、 收集已分选的细胞核，放入15 mL锥形管中，内含1 mL预冷的1%牛血清白蛋白-磷酸盐缓冲液(BSA-PBS)。

6、 为确认收集到的细胞核的纯度，样品经SYTOX Green染色(最终浓度为5 nm)后分选一等份。Sytox Green荧光用488 nm激光激发，用505LP和530/30bp的滤光片收集。

7、 将7-AAD分选后的细胞核在4 ℃下500 ×g离心10 min。

8、 去掉上清液，在150μl的1%牛血清白蛋白-硫代巴比妥钠溶液中轻轻地重新悬浮细胞核。

使用BD FACSAria II细胞分类器分离细胞核的门控策略

三、细胞核的渗透稳定

1、在细胞核悬液中加入1 % NIB培养基，并添加2 % Triton X-100，以达到0.5 %的最终Triton X-100浓度(例如，每1.5 mL NIB过滤细胞核悬液添加0.5mL NIB培养基 + 2 % Triton X-100)。

2、在4°C(速度2)下对拟南芥进行温和摇晃5 min。

3、将拟南芥细胞核在500×g和4 ℃下离心8 min，将其制成颗粒核，在500×g和4 ℃下离心5 min，得到大个颗粒核(时间和速度因植物种类和细胞核大小而异)。去掉上层清液。

4、用4 mL 1 % BSA-PBS洗涤颗粒。通过旋转轻柔地使细胞核颗粒重新悬浮。

5、如步骤3所述对细胞核悬浮液进行离心。去掉上清液。

6、用10× Genomes公司提供的细胞核缓冲液重新悬浮细胞核颗粒。体积可以根据细胞核浓度进行调整，以满足10X Genomes要求。

四、细胞核浓度的计算

9μL的核悬浮液加1µL的0.4 %台盼蓝，混匀，将染色细胞核全部体积转移到细胞计数室载玻片中，估算核密度。

殷肖明 | 文案