一、实验目的

磷脂酰丝氨酸 (phosphatidylserine，PS)：又称复合神经酸，位于正常细胞膜的胞质一侧，在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜胞质侧翻转到细胞膜外表面。基于此现象，利用Ca2+依赖性Annexin V可与PS特异性结合，且亲和力高，适用于细胞凋亡早中期的检测。

PI为核酸染色剂，与细胞核结合将细胞核染为红色，PI不可透过正常的细胞膜，可透过凋亡中晚期以及坏死细胞的细胞膜，适用于在排除细胞坏死的前提下，细胞中晚期凋亡的检测。

在本次实验中，采用HeLa细胞的对照组和H2O2诱导组，将Annexin V与PI同时使用，通过流式细胞仪分群表征出正常、坏死、凋亡和机械性损伤的细胞群。

二、实验步骤

1.染色前处理

1.1 将收集到的细胞，用预冷1XPBS (4 °C)重悬一次，300Xg , 离心5min，弃上清，收集细胞；

1.2 加入300μl的1X FACS Buffer重悬细胞，调整细胞浓度至1X106个/ml；

2. Annexin V/PI 染色

2.1 取流式管，按顺序编好空白管，单阳管和样本管号；流式管中分别加入经200目细胞过滤膜过滤好的100 μl细胞悬液，单阳管中分别加入5 μl Annexin V或10μl PI 碘化丙啶轻轻混匀；

2.2 样本管加入5 μl Annexin V-Alexa Fluor™488轻轻混匀，再加入10μl PI 碘化丙啶轻轻混匀；

2.3 室温避光孵育10~20min，加入400μl 1X FACS Buffer，冰上放置，上机检测；

三、结果与分析

圈门逻辑：图1通过前向(FSC)和侧向(SSC)，分别圈出对照组和H2O2诱导组的HeLa细胞范围，诱导凋亡组的细胞已呈现出分群的趋势；图2为 Annexin V/PI双标记的结果，2A所示对照组的HeLa细胞处于正常状态，有少许凋亡晚期的细胞，属于正常培养凋亡；经H2O2诱导HeLa细胞出现了显著的早期凋亡现象，

比例由1.06%增至7.43%；凋亡晚期的细胞比例呈明显增长趋势。

结果判读：Annexin V标记的单阳性细胞为凋亡早期细胞；Annexin V与PI双标记的双阳性细胞为凋亡晚期细胞；PI标记的单阳性细胞为坏死细胞；两者均未标记上的双阴性细胞为活细胞。

四、实验注意事项

① 如果用含 EDTA 的胰酶消化时，需要在标记前用 1× PBS洗涤，清除EDTA，以免残余的EDTA与Ca2+螯合，影响 Annexin V 的结合；

② Annexin V和PI是光敏物质，在操作过程中要全程避光；

③ 操作过程轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4°C/湿冰下操作，以免影响细胞状态；

④ 为防止荧光衰变，最好1h内进行流式检测；

⑤ PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议先进行Annexin V染色，PI可在上机前5min再染；

⑥ PI属于强染料，检测完，流式仪器要进行充分清洗；