神经递质调节动物的神经功能和福祉，需要神经系统激素之间的平衡互动以维持身体正常功能。在这些神经递质中，多巴胺作为一个关键的神经调节剂脱颖而出，它在调节认知、情感如快乐或愉悦以及运动技能方面发挥着核心作用。人类多巴胺浓度的失调与一系列神经退行性疾病如帕金森病和阿尔茨海默病、神经发育状况如注意力缺陷多动障碍（ADHD）和图雷特综合症以及心理并发症如双相情感障碍和精神分裂症有关。此外，异常的多巴胺水平可以作为特定类型癌症的诊断指标。因此，准确可靠地检测多巴胺浓度对于药物研发和医疗治疗的发展至关重要。传统技术使用基于抗体的酶联免疫吸附测定（ELISA）或高效液相色谱法（HPLC）进行多巴胺分离，结合荧光光谱法、比色分析、质谱法或电化学活性等检测方法。然而，这些方法在试验准备、可行性、响应时间长和选择性方面存在复杂性，使它们不适合即时护理应用。此外，直接从未经处理的全血中高准确度和特异性地检测多巴胺面临着相当大的挑战，主要是由于其低浓度和干扰分子的存在。标准的检测方法通常采用间接方法，针对主要的多巴胺代谢产物如高香草酸（HVA），或使用儿茶酚胺测试，测量多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素的综合水平，但缺乏特异性且需要复杂样品制备。
近几十年来，电化学方法，如循环伏安法，已成为直接、免标记检测多巴胺的有前景的工具，因其简单、成本低和响应迅速。这些方法涉及用各种传感增强剂修改电极，为检测提供了可行的替代方案。然而，由于多巴胺和其他几种结构相关的儿茶酚胺神经递质具有相似的氧化还原电位，特别是在血液或大脑中的脑脊液等复杂基质中，实现选择性仍然是一个主要挑战。此外，电活性环境可能产生不需要的氧化产物，导致电极生物污染，最终导致性能差和传感器不稳定。光学传感器是敏感且免标记检测这类小分子的有力候选者，许多此类研究已显示使用光子、等离子体或光电子响应进行定量分析。然而，尽管这些系统多功能，但仍存在问题，如选择性、可重复性和可靠性。
适体，人工生物受体，已成为几种神经递质，包括多巴胺特异性检测的优秀候选者。这些通常是短的单链RNA或DNA（ssRNA或ssDNA）–基于寡聚体蛋白，具有特定的核苷酸序列，能够以高亲和力选择性地结合到特定目标分子上。适体可以针对广泛的配体，范围从简单的离子和小分子，如神经递质，到大分子如蛋白质、肽、病毒甚至整个细胞。适体通常通过SELEX（指数富集的配体系统进化）程序从RNA或DNA库中体外选择。由于合成简便、保质期长和高特异性，它们已作为生物传感器中的受体应用于临床诊断和治疗。最近的研究已经展示了几种多巴胺特异性适体的开发，第一个是基于RNA的适体。然而，由于RNA的稳定性有限且合成困难，随后开发了一个DNA同源物（57个碱基对）以提高对多巴胺的特异性和亲和力。最近，一个更短的DNA适体（44个碱基对），通过直接选择获得，据报道表现出更高的亲和力和选择性。尽管这两种DNA适体在各项研究中显示出对多巴胺检测的潜力，但近期关于其特异性的矛盾结果使全面理解变得复杂。
近年来，对基于血液的神经递质检测方法的需求日益增长，这些方法不仅需要提供灵敏和选择性的响应，而且还必须经济、可靠且用户友好。传统的技术如高效液相色谱（HPLC）和酶联免疫吸附测定（ELISA），配合各种检测方法，受到样本准备复杂性、响应时间和选择性的限制。此外，传统的血液检测方法通常针对主要的多巴胺代谢物如高香草酸（HVA）或使用儿茶酚胺测试，但缺乏特异性。总的来说，灵敏度不足、特异性差、响应时间长、复杂度高和成本高昂使得这些方法不适合现场护理应用。
神经递质对于神经系统的正常运作至关重要，其中多巴胺在认知、情感和运动控制中发挥着关键作用。多巴胺水平的失调与多种疾病有关，这凸显了在研究和诊断中准确检测多巴胺的需求。单链DNA（ssDNA）适配子因其选择性、改进的稳定性和合成可行性而成为多巴胺检测的有前景的生物受体。然而，多巴胺特异性的差异带来了挑战。在这里，中佛罗里达大学纳米中心Debashis Chanda教授课题组，用一种对多巴胺具有特异性的ssDNA适配子表面功能化了一个纳米等离子体生物传感平台，用于选择性检测。该生物传感器具有窄带混合等离子体共振特性，通过适配子的功能化和钝化过程实现了高特异性。在包括蛋白质溶液、脑脊液和全血在内的各种生物样本中，展示了对多巴胺检测的灵敏度和选择性。这些结果突出了等离子体“适配子传感器”在开发快速准确的诊断工具方面的潜力，这些工具可用于疾病监测、医学诊断和针对性治疗。
多巴胺原位检测系统概念图
所提出的生物传感平台由一个表面功能化的高灵敏度等离子体传感器组成，该传感器与基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控芯片集成，用于在生理液体中进行检测，如图1A所示。等离子体传感器由一系列三维（3D）孔盘排列的光学薄金属组成，这些金属非对称地耦合到下方的共振腔，并在其下方有一个反射器，如我们之前的工作中所展示。图1（B和C）分别展示了纳米结构表面的扫描电子显微镜（SEM）图像（顶部）和制造的等离子体生物传感器的垂直横截面（底部），提供了其形态和结构的详细洞察。纳米结构表面采用大面积并行纳米压印方法制造，能够制造出坚固可靠的传感器，在可见-近红外光谱区域展现出多个混合等离子体共振。这是由于顶部局部表面等离激元（LSP）模式与光子腔模式之间的强耦合，导致对有效折射率局部变化高度敏感的强窄带混合共振。之前的工作已经展示了可靠复制窄带等离子体响应的能力，这可以通过自动化压印方法得到增强。腔耦合等离子体生物传感器在光谱混合等离子体共振处，在纳米结构表面上显示出多倍增强的局部电场强度。有限差分时域（FDTD）模拟的电近场幅度剖面图在不同的视角下显示了一个这样的LSP共振（LSPR；波长，842 nm），如图1（D，顶部和E，横截面）所示。图1D中的电场模式（xy平面）由于入射激发的偏振是线性的，在xy平面内呈现偶极状。腔体由紫外（UV）固化的负性环氧抗蚀剂SU-8组成，提供结构刚性。为了减轻生物传感应用中环氧树脂膨胀可能引起的不可预测和不可逆转的光谱信息变化，在纳米压印后使用原子层沉积（ALD）技术沉积了一层20纳米的均匀一致的铝氧化物（Al2O3）涂层，以防止不希望的流体扩散进入环氧树脂。此外，等离子体表面由30纳米厚的光学薄金制成，通过电子束（e-beam）沉积涂覆，确保了惰性，因此在几乎所有环境条件下都表现出可忽略不计的氧化和反应性。
低浓度多巴胺检测的功能化测定法
为此，选择了两种不同碱基对长度的定制修饰巯基终止（─S═S─）ssDNA基适体（Integrated DNA Technologies Inc.），一种有57个碱基对，另一种有44个碱基对。这两种定制ssDNA适体根据其碱基对长度被命名为“57-mer”和“44-mer”，它们具有相似的储存条件、活化和表面功能化协议。图2A展示了表面修饰和检测的总体策略示意图。原始传感器最初用巯基激活的适体进行功能化，这些适体与金共价结合，创建了一个特异性选择多巴胺的单层。即便如此，在未过滤或最小纯化的生物样本（血液、血浆基质或脑脊液）中检测生物标志物可能因蛋白质在带负电的金表面上的静电积累而导致不想要的生物膜吸附，从而阻碍了由于所需生物标志物选择性结合而获得的实际正信号。为了缓解这个问题，随后在表面上涂覆了基于巯基终止的6-巯基-1-己醇（6-MCH）自组装单层的表层钝化技术。这种方法是钝化金基平台的常见策略，有助于减轻蛋白质生物污染的问题。在进行表面修饰后，系统的远场反射响应略微红移（图2C），这被视为我们目标分析物检测的基线。在传感器用硫醇化ssDNA适体功能化并用MCH化学方法进行表面钝化后，激活的系统准备好进行后续的测量和测试，涉及适体选择和通过光学光谱及分析进行的多巴胺检测（详见材料和方法部分）。图2B展示了使用原子力显微镜（AFM）成像的生物传感器表面形貌。这里的表面轮廓由AFM尖端的第一阶力学相位振幅（M1P）表示，它携带了有关表面“柔软度”的信息。由于适体功能化后表面变化最小（几纳米），因此在z变化轮廓中无法区分，但在相位轮廓中可以观察到明显的表面形态变化（图2，B和C）。
评估表面覆盖度以高效检测低浓度多巴胺
我们最初测试了两种浓度的适体，1和10μM，如图S3所示。对于缓冲溶液中的低浓度多巴胺（1nM），具有1μM适体覆盖度的设备的响应落在基线分辨率内。因此，后续测量使用了10μM的适体浓度进行。接着，我们在PBS溶液中准备了几个不同浓度的多巴胺，并将它们孵育在功能化的传感器表面上20分钟。孵育后的传感器用分子级水彻底冲洗并空气干燥，然后进行后续的光谱测量。图4A显示了PBS中各种浓度多巴胺的LSPR偏移，直到低至1nM的浓度。我们观察到随着多巴胺浓度增加，测量到的LSPR偏移呈现出良好的S形趋势（类似于累积分布曲线），这里显示高达10mM，表明了测量装置的广泛动态浓度范围。此外，多巴胺存在几个结构相关的前体和代谢物，这些物质可能会干扰准确检测并阻碍测定的可靠性。随后，我们进行了测量，以检查在存在与多巴胺密切相关的潜在干扰神经递质物种时，所提出的检测平台的特异性。图4B显示了在将生物传感器与几种潜在干扰神经递质分子（如l-3,4-二羟基苯丙氨酸（l-DOPA）、肾上腺素、3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）和HVA）孵育后获得的LSPR偏移，这些物质在PBS中以10mM的浓度制备，遵循与之前实验相似的测定协议。通过在生物传感器上孵育未受扰动的PBS建立了基线对照测量。还描绘了PBS中相当浓度多巴胺的观察偏移。所有测量到的干扰物种响应一致地处于或低于基线，与观察到的类似浓度多巴胺的响应形成对比，证明了功能化和钝化的生物传感平台具有出色的特异性和抗生物污染能力。
不同生物基质中的检测和生物污染研究
在实际应用中，生物传感器的性能至关重要，特别是在含有多种干扰分子（如蛋白质、脂质、血细胞和神经递质）的动态测定中。为了评估生物传感器在这种情况下的效能，进行了两种不同生物基质：BSA和aCSF的评估。BSA是一种与人类血清白蛋白化学相似的标准蛋白质，因其已建立的蛋白质浓度基准而被使用。将冻干的BSA溶解在PBS缓冲液中，制成0.1% w/v的溶液，向其中加入不同浓度的多巴胺，并滴铸到后功能化的生物传感器表面。同样，将掺有多巴胺的aCSF滴铸到钝化的生物传感器上。在室温下孵育20分钟后，轻轻冲洗生物传感器，空气干燥，并进行光学光谱收集。图4（C和D）分别说明了在掺有多巴胺的BSA和aCSF溶液中不同多巴胺浓度的LSPR偏移。观察到未掺入多巴胺的BSA孵育的LSPR偏移约为0.47±0.07 nm，略高于之前的情况。相比之下，不含多巴胺的aCSF的LSPR偏移显著更高，为2.31±0.59 nm。尽管如此，随着多巴胺浓度的增加，LSPR偏移呈现出一致的增长趋势，表明生物传感器具有特异性和抗表面结合效应的能力。此外，不同多巴胺浓度下LSPR偏移的一致单调趋势凸显了生物传感器的优越选择性，测得的检测限约为100 pM（对于BSA）和90 pM（对于aCSF）。
在现场护理诊断和便携式生物传感器应用中的主要障碍在于有效检测未处理或最少处理的复杂样品（如全血）中的生物标志物，其中生物污染以及恶劣的环境条件可能破坏生物亲和力层，使其无法用于检测。为了解决这个问题，我们使用了一个基于流动的系统，该系统整合了功能化等离子体生物传感器和一个源自我们早期工作的片上透明微流体流动通道。如图5A所示，该设置具有双入口和出口，用于引入缓冲溶液和目标检测基质（例如，全血）。在实验协议中，用PBS溶液中的多巴胺对牛全血（约35%的血细胞比容）进行掺加，以产生不同的多巴胺浓度，同时保持血细胞比容水平一致（详见材料和方法部分的程序）。对照样本由与未掺加PBS等体积混合的全血组成。
未处理全血中多巴胺的检测
为了启动实验，首先通过一个入口以低流速将PBS缓冲液引入功能化传感器区域，直到LSPR信号稳定。随后，封闭PBS通道，并通过第二个入口引入血液样本，覆盖传感区域。经过2分钟的流动期后，系统被允许孵育5分钟。孵育结束后，重新引入PBS溶液以去除多余的血液成分，包括血细胞、血浆和蛋白质。图5B展示了在这些流动步骤中不同浓度多巴胺血液的LSPR信号的动态演变，包括未掺加多巴胺的血液（对照）。在整个血流阶段，观察到跟踪的LSPR信号出现显著的红移，这种红移在孵育期间持续存在，偶尔由于近场折射率的动态变化（如大分子血细胞的引入和光谱跟踪的暂时丢失）而出现扰动。然而，用PBS缓冲液冲洗后，LSPR跟踪信号得以恢复，尽管由于多巴胺结合略有基线偏移。冲洗后基线LSPR偏移的变化（图5B）表明了通过功能化适体捕获多巴胺导致的表面修饰。值得注意的是，没有多巴胺的对照组显示出极小的基线偏移（约0.042±0.031 nm），表明生物传感表面对外来污染具有出色的稳定性和抵抗力。图5C展示了实验确定的与血液中掺加不同浓度多巴胺相对应的差异基线LSPR偏移，表明检测限在1 nM范围内。与传统需要大量样本准备的检测技术相比，提出的生物传感平台可以直接且高度特异性地从全血中检测神经递质多巴胺，响应时间仅需5分钟，为直接从未经处理的血液中实时监测多巴胺铺平了道路。
中佛罗里达大学Debashis Chanda教授课题组，工作展示了一种全光学的、基于适体的等离子体生物传感器，其在检测神经递质多巴胺方面表现出了卓越的灵敏度和选择性。该生物传感器的表面用对多巴胺具有显著特异性的硫醇修饰适体进行了功能化，同时一个基于MCH的自组装钝化层最小化了生物污染。两种不同的硫醇修饰ssDNA适体的光学传感性能比较揭示了较短链的44聚体作为最佳候选者。此外，在PBS溶液和像掺加BSA的溶液及aCSF这样的生物基质中进行的传感实验展示了出色的皮摩尔级浓度依赖性相关性和来自类似多巴胺相关试剂的最小交叉干扰。更进一步，该生物传感器能够直接从全血中检测多巴胺，检测限为1 nM，响应时间快达5分钟，展现出卓越的选择性和灵敏度，凸显了其在即时诊断和便携式生物传感器应用中的潜力。由于改性适体与传感器表面之间的硫醇-金共价键的稳定性，传感器的重复使用是困难的，需要复杂的化学清洗协议，因此在每次检测测量后都被丢弃。尽管如此，易于制作的工艺允许批量生产这类生物传感器，使其健壮且可靠。此外，集成的微流控生物传感芯片能够通过简单的光学响应直接且快速地从最少处理/未处理的复杂基质中测量神经递质。这一平台有望满足实时监测神经学生物标志物的未满足需求，并通过早期准确检测神经递质失衡来改善患者护理。
Nanoplasmonic aptasensor for sensitive, selective, and real-time detection of dopamine from unprocessed whole blood. Sci. Adv.10,eadp7460(2024). DOI:10.1126/sciadv.adp7460
