什么是生物交联？
生物交联反应包括对蛋白质、核酸、糖及脂类等生物大分子的化学修饰。由于蛋白质化学结构的多样性，对蛋白质分子的生物交联反应研究较为广泛，主要包括对赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸残基及对蛋白质氨端及羧端的修饰。由于蛋白质分子具有大量内源的氨基酸残基，生物交联反应一般仅具有对氨基酸残基的选择性，而对于不同位置的氨基酸残基不具有选择性。对于特定位置具有选择性的生物交联反应被称为生物正交反应，一般反应基团为外源的化学官能团。
交联剂 (也称为双功能交联剂) 是含有两个或更多反应性基团的试剂，这些反应基团通过间隔与蛋白或其他生物分子上的官能团共价连接。有三种类型的交联剂可供选择：同型双功能交联剂，异型双功能交联剂和光反应性交联剂。同型双功能交联 试剂具有相同的反应基团，主要是胺对胺或巯基对巯基。它们通常用于形成分子内交联或从单体中制备聚合物。异型双功能交联 试剂具有不同的反应基团，如胺对巯基，羧基对胺或巯基对羧基。它们可用于制备两种不同生物分子之间的偶联物。异型双功能交联试剂还包括在暴露于紫外光后与亲核试剂反应或形成 C-H 插入位点的光反应性交联试剂。
细胞生命活动的有序运转依赖的并不是单个分子的“单独行动”，而取决于各种分子形成的功能复合体，因此解析这些功能复合体中各种分子间的相互作用对于深入理解与解析细胞生命活动至关重要。此外功能复合体在细胞中并不是恒定不变的，如何通过“快照”的方式，获取这些复合体的互作关系也就成了该领域的一个重要研究热点和难点，而依靠不断发展的分子交联技术，我们现在已经可以获得单核苷酸精度的分子互作图谱。
经过几十年的长期发展，人们开发了许多分子交联试剂
以下将简述分子生物学中常用的几种分子交联方式的原理与应用。今天分享的是基于有机化学试剂的分子交联：甲醛，多聚甲醛和戊二醛。
甲醛（Formaldehyde ）
甲醛能介导蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA的共价交联，并且这种交联是可逆的。甲醛交联的机制是DNA碱基上的氨基与亚氨基和蛋白质上的赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸的侧链氨基均可以和甲醛发生缩合反应，分别形成共价键，最终形成甲醛连接的DNA/RNA/protein复合体[1]。甲醛交联产生的共价键可以解交联。
相关应用：ChIP，RIP，CLIP，ChIRP等
甲醛介导的分子交联
多聚甲醛（Paraformaldehyde ）
多聚甲醛是甲醛的聚合物，性质比甲醛稳定，且对抗原的破坏能力弱于甲醛。多聚甲醛介导的分子交联与甲醛原理一样。组织学上，4%的多聚甲醛穿透力强，固定均匀，能使组织硬化。
相关应用：IHC，FISH，IF
甲醛与多聚甲醛转化反应
戊二醛（glutaraldehyde）
戊二醛中的羰基可与蛋白质氨基酸以及DNA/RNA碱基中的氨基反应，形成共价化学键，蛋白质，RNA，DNA交联。
相关应用：ChIRP
戊二醛介导的分子交联
除了前面介绍的使用甲醛，多聚甲醛和戊二醛等有机试剂进行分子交联外，另一类常用的分子交联技术就是基于光化学反应的光交联，尤其是紫外线介导的光交联反应。
紫外线（ultraviolet ）
光也能接到化学反应，即光化学反应[1]，它是指物质在可见光或紫外线照射下，物质分子吸收光子后所引发的化学反应。而基于光化学反应的光交联则是其重要应用之一。光交联反应是指将合成的光敏小分子化合物作为工具探针，在特定波长的光照射下，产生高活性的中间体，与其受体活性部位形成特异性的不可逆共价键结合的化学反应。
在分子生物学中，常使用紫外线进行光交联反应，用于邻近分子的交联。紫外线为波长在10nm至400nm之间的电磁波。紫外交联主要介导蛋白质与RNA的分子共价连接，常用紫外线波长有254nm和365nm两种。其中254nm UV照射下，RNA 中的核苷酸和蛋白质中的氨基酸会产生光化学反应，转变为活性状态，进而形成分子间共价交联，不过254nm UV介导的分子交联效率偏低（HIST-CLIP使用254nm UV进行交联）；而365nm UV则可以介导光敏分子，例如4SU与蛋白质的高效交联（PAR-CLIP使用365nm+4SU进行交联）。
紫外介导的分子交联[2]
紫外介导的分子交联[3]
紫外介导的分子交联[3]
补骨脂素（Psoralen）
在长波长紫外光（365nm）的激发下，补骨脂素能够嵌入富含胸腺嘧啶或者尿嘧啶的双链区域，并与胸腺嘧啶或者尿嘧啶发生共价交联，可以用于双链DNA，双链RNA或者DNA-RNA杂合链的鉴定与分离。并且365nm条件下补骨脂素介导的交联可以在254nm UV处理后进行解交联。
Psoralen介导的核酸分子交联
AMT
AMT（4’-aminomethyltrioxalen），一种补骨脂素衍生物交联剂，可以使RNA与RNA间通过尿苷产生交联，适用于直接的RNA-RNA相互作用。
基于AMT的RNA-RNA互作分析[4]
Reference
1.孙瑞, 高银佳, 史海斌. 光交联技术的生物应用研究进展[J]. 中国光学, 2018, 11(3): 444-458.
2.Urdaneta, E. C. & Beckmann, B. M. Fast and unbiased purification of RNA-protein complexes after UV cross-linking. Methods 178, 72-82 (2020).
3.Ascano, M., Hafner, M., Cekan, P., Gerstberger, S. & Tuschl, T. Identification of RNA-protein interaction networks using PAR-CLIP. Wiley Interdiscip Rev RNA 3, 159-177 (2012).
4. Zhipeng, L. et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell (2016).
一、京尼平简介
交联剂已经被广泛地应用于细胞膜结构、蛋白质结构、蛋白质间相互作用、生物导弹、载体蛋白与半抗原的连接、蛋白质或其他分子的固相化及抗体的标记等生物领域的研究。常用的交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺2,2′二磺酸、1,5二氟2,4二硝基苯与己二酰亚胺酸二甲酯等。但这些化学交联剂在使用中存在毒性高，污染严重等缺点。因此，寻求一种低毒性、生物可降解的交联剂来代替戊二醛已非常必要。
京尼平是生产蓝色着色剂的前体。这些着色剂的形成涉及京尼平和氨基酸、肽和蛋白质中存在的伯胺之间的交联反应。京尼平（Genipin）是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，是一种优良的天然生物交联剂。一般采用从栀子中提取京尼平苷，再用β-葡萄糖苷酶水解，然后用乙醚萃取、真空浓缩、重结晶而制得，也可以采用微生物转化法制备[1、2]。栀子属于茜草科植物，是我国盛产的一种中药材，具有利胆、保肝等功效，在我国应用于临床治疗已有1600多年历史[3]。栀子果实的化学成分很多，主要包括藏红花素类、栀子苷类和多元酚类，其中栀子苷的主要成分为京尼平苷[4]。京尼平苷是一种环烯醚萜葡萄糖苷，无毒、易溶于水，京尼平苷在杜仲和栀子中含量均较高，达到3%~8%左右。
Djerassi等[5]早在1960年就利用核磁共振光谱数据和化学降解实验发现了京尼平，其分子式为C11H14O5，属于环烯醚萜类物质，京尼平苷与京尼平的结构式可见图1.2。京尼平本身是无色的，但是它与氨基酸发生反应后，会产生蓝色化合物，这种蓝色化合物是可以食用的，现在已被用在食品着色剂中[6]。
二、京尼平交联机理
随着京尼平参与明胶、壳聚糖等交联反应的广泛化，其交联反应机理也先后被报道[1,7-9]。图1.3为含氨基聚合物与京尼平交联反应的示意图[9]。京尼平交联明胶、壳聚糖等含氨基基团的化合物的机理最为成熟的是pH依赖型机理[2]。在不同的pH条件下，京尼平与壳聚糖等的交联机理不同。
1.在酸性和中性条件下，壳聚糖上的氨基基团亲和攻击京尼平C-3位的烯碳原子，二氢吡喃环打开，形成杂环胺，这样可以形成由短链京尼平为交联桥的网状结构聚合物。这种通过壳聚糖的氨基集团对京尼平上的酯基进行亲核取代的反应，在酸催化的条件下才能发生。
2.在碱性条件下，水溶液中的OH亲核攻击京尼平，京尼平开环形成一个醛基中间体，开环京尼平单分子醛醇缩合形成大分子聚合物。聚合京尼平的末端醛基可以和壳聚糖上的氨基进行Schiff碱反应，形成交联网状结构。这说明京尼平分子可以先进行聚合，以形成长链京尼平交联桥的网状结构聚合物。因此，环境的pH条件对京尼平交联明胶、壳聚糖等胶体制备中的交联反应有很大影响。交联键的性能和长度取决于交联反应的pH。在酸性条件下，通过壳聚糖产生的京尼平C-3中碳的亲核攻击由于氨基的质子化而受到抑制。与之相反，酸催化改善了京尼平酯基的亲核取代反应，形成了带有壳聚糖的二次酰胺。京尼平交联明胶、壳聚糖等形成的网络结构在这种情况下是由交联短链制备而成的。相反，随着碱性的增强，京尼平将更容易在交联明胶、壳聚糖等之前，先进行自身聚合反应。因此，在强碱条件下，京尼平交联明胶、壳聚糖等形成的网络结构是由交联长链组成的[2]。
三、京尼平的应用
京尼平是一种低毒性、生物可降解的天然化合物，近年来，作为交联剂在生物及医学领域得到了广泛应用。京尼平除了是一种中医药材之外[4,10]，还可以与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖等交联制作生物材料，如人造骨骼、伤口包扎材料等，其毒性远低于戊二醛和其他常用化学交联剂。京尼平也可用做指纹采集试剂和制备固定化酶的交联剂。
1.京尼平在医学领域的应用
京尼平作为一种新型生物交联剂，形成的交联制品稳定性强、细胞毒性小、生物相容性好、不发生降解与钙化等。京尼平在药物控释材料方面的应用近年来有大量的研究报道[10-11]，这些研究都表明，京尼平作为一种天然生物交联剂，其交联反应温和，交联度可控，成为植入式药物缓释系统的良好载体，对蛋白类药物的控释缓释具有显著的优势。京尼平也已成功应用于人造生物敷料、异体组织、人工血管、组织工程血管、人工骨和骨缺损修复等[12-14]。
2.京尼平应用于食用色素和生物检测显色剂
目前在食品工业越来越要求使用天然食用色素，但在众多的天然色素中，作为三原色的红、黄、蓝，蓝色素品种较少，稳定性较差，因而研究天然蓝色素成为急需解决的一项课题。将京尼平与氨基酸反应，可制得的一种安全无毒的食用天然色素，它耐热、耐光、耐酸碱，pH适应范围广，易溶解于水和低醇，可替代化学合成蓝色素单独使用，也可以与红、黄类色素调配成绿、紫、棕等色调混合使用，在国外被广泛用于食品、药品及化妆品等产品的着色[69]。京尼平除了用于食用色素外，还可以用作显色剂测定氨基酸的含量。Lee等[15]利用从栀子中提取的京尼平苷水解的京尼平，建立了一种新的氨基酸的测定方法。京尼平与氨基酸反应呈蓝色，与水合茚三酮显色系统相比，摩尔吸光系数最大可增大14倍，灵敏度更高，且系统受杂质影响较小，低浓度的金属离子Cu2+和Fe3+对吸光度基本无影响。
3.京尼平作为固定化酶交联剂
京尼平作为一种天然生物交联剂，在固定化酶中的应用也有相关报道。Fujikawa等[16]用京尼平交联细胞色素C，凝胶电泳结果显示，京尼平可以使细胞色素C分子之间交联，形成细胞色素C齐聚体。他们还采用海藻酸钙凝胶固定β-葡萄糖苷酶[17]，结果显示，使用京尼平比用其他交联剂所得的固定化酶酶活性高，重复使用12次后，酶活仍保持在100%。随后，京尼平也被应用在了糖化酶、蛋白酶和柚苷酶的固定化中，并申请了专利[18]。
参考文献：
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