CCK-8实验，全称为Cell Counting Kit-8实验，是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性检测的实验方法。其基本原理基于CCK-8试剂中的WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)在电子载体存在下，被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物(Formazan)。甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，因此可以利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

一、实验原理

WST-8在电子耦合剂(如细胞中的NAD+)存在下，被脱氢酶还原成橙黄色的甲瓒产物。

细胞增殖越多越快，颜色越深;细胞毒性越大，颜色越浅。

二、实验应用

CCK-8实验可应用于多种生物学研究领域，包括但不限于：

细胞增殖测定

细胞毒性测定

细胞活性测定

药物筛选

肿瘤药敏试验

微生物对细胞毒性或增殖的测定

三、实验步骤

细胞准备：

制备细胞悬液并进行计数。

在96孔板中接种细胞悬液，每孔约100μL，通常每孔细胞数在1000-7000个之间，具体取决于细胞类型和实验需求。

将培养板放入培养箱中预培养一段时间(通常为24小时)，使细胞贴壁。

实验处理：

根据实验需求，向培养板各孔中加入不同浓度的待测物质(如药物、化学试剂等)。

将培养板放回培养箱中继续孵育一段时间(如6、12、24或48小时)。

CCK-8检测：

每孔加入10μL CCK-8溶液，注意避免产生气泡。

将培养板放回培养箱中孵育一段时间(通常为1-4小时)，具体时间取决于细胞类型和实验需求。

使用酶标仪在450nm处测定各孔的吸光度(OD值)。

四、数据处理

细胞存活率或增殖率计算公式：细胞存活率/增殖率 = [(As - Ab) / (Ac - Ab)] × 100%

As：实验孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液和待测物质)。

Ac：对照孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液，不含待测物质)。

Ab：空白孔吸光度(含培养基、CCK-8溶液，不含细胞和待测物质)。

五、注意事项

实验条件控制：确保实验过程中温度、CO₂浓度等条件稳定。

细胞状态：选择生长状态良好、分布均匀的细胞进行实验。

加样操作：加样时要避免产生气泡，以免影响OD值读数。

孵育时间：根据细胞类型和实验需求调整孵育时间。

数据记录：准确记录实验过程中的各项数据，以便后续分析。

六、总结

CCK-8实验是一种简便而准确的细胞增殖和毒性检测方法，通过测量甲瓒产物的生成量来反映活细胞的数量和状态。在实验过程中，需要注意控制实验条件、选择适当的细胞状态、避免加样操作中的误差以及准确记录实验数据。

【隆科生物合作项目】

病理检测：石蜡包埋、切片、HE染色、masson染色、番红固绿染色、天狼星红染色、免疫组化、免疫荧光单标/双标/多标、全景扫描、激光共聚焦拍照等。

分子生物学实验：荧光定量PCR检测、Western blot检测、血常规、生化酶活、ELISA检测等。

细胞实验：耐药细胞株构建、细胞毒性实验、细胞迁移实验、细胞侵袭实验、细胞流式周期检测、细胞流式凋亡检测等。

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微生物学实验：抑菌试验、药敏试验、菌种鉴定、微生物多态性分析等实验。