Western Blot作为基础生命科学检测方法之一，目前已经有适配性较高的通用型实验检测方案和流程。

但蛋白质作为一个特异性较强的检测指标，总会有一些并不适用于常规方法，且需要我们对实验步骤进行优化或者修改，才能保证得到较为理想的结果。

如果你研究的蛋白分子量较大或较小，且苦于一直跑不出好看的WB结果，那么这篇文章一定可以帮到你！

WB实验一般流程

一、什么是大/小分子蛋白

1）大分子蛋白

大分子蛋白一般指WB检测中分子量＞200kDa的蛋白质，由于其分子量大，迁移速度慢，转膜困难等特征，这类蛋白质的迁移和转移可能会受到影响，因而在WB实验中有时难以获得清晰条带。

2）小分子蛋白

小分子蛋白主要指WB检测中分子量＜20kDa的蛋白质，由于分子量小易降解，且带电荷量也相对较少，所以导致其吸附能力比较弱，所以常用的蛋白WB步骤通常会导致检测结果不稳定，时有时无，甚至出现转膜失败、蛋白弥散等完全看不到目标条带的情况。

针对大/小分子蛋白的WB检测，应该对实验步骤进行优化，以实现实验结果的准确性。

二、大分子蛋白实验步骤优化

1）样品制备

大分子量蛋白在提取时会比较困难。很多大分子量蛋白为膜蛋白，膜蛋白属于非可溶性蛋白，且表达量通常较低，一般使用溶液法（RIPA等）裂解时，通常会丢失在不可溶组分中，所以要选择合适的方法来进行蛋白的提取或富集。提取总蛋白时建议适当延长裂解时间，有助于大分子量蛋白的充分裂解。 

2）凝胶上样、电泳

① 凝胶制备

主要有Tris-Glycine, Bis-Tris and, Tris-Acetate3种：Tris-Glycine凝胶的PH为8.6，Bis-Tris凝胶的PH为6.4，Tris-Acetate 凝胶的PH为7。

经验分享：这里推荐使用Tris-Acetate 凝胶跑大分子蛋白，会呈现更高的分辨率。凝胶浓度与孔径成反比，即凝胶浓度越小，孔越大，较大分子量的蛋白质更容易通过，所以建议使用6-8％浓度的分离胶，当然有条件也可以使用梯度凝胶。

② 电泳技术

丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。

它有两种形式：SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）及非变性聚丙烯酰胺凝胶（Native-PAGE）。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺聚合而成，形成一个三维网状的结构，它具有分子筛效应。

▲SDS-PAGE分离胶浓度&最适分离范围 

▲聚丙烯酰胺浓度&蛋白分离范围

▲传统制胶配方

③ 电泳电压选择

电泳时可采用120-150V的高电压，在冰水浴中进行，尽量使Marker拉开足够大的距离，通常需要4h左右。

经验分享：电压120V，4 h，245KD Marker条带差不多到分离胶中间位置，蛋白上样缓冲液会漏到电泳槽，不要回收电泳液，以免污染下一次实验的结果。

3）转膜

① 膜的选择

转印膜一般有PVDF膜或NC膜。跑大分子蛋白选择PVDF膜。如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀。而PVDF膜不需要在转移buffer中添加甲醇，目的蛋白转印的机会更高。

2种类型的膜都有各种孔径尺寸，最常见的是0.2um和0.45um。与凝胶一样，较大的蛋白比较小的更容易穿过大孔隙。大多数蛋白质（> 20kDa）可以用0.45um膜转移，避免使用0.2um孔径。

② 切胶

浓缩胶不要切得太过，因为很有可能条带就在浓缩胶和分离胶交界以下2mm处；有可能许多分子量超过250KDa的蛋白就残留在浓缩胶中。

③ Transfer buffer（转膜液）

Transfer buffer中的甲醇容易让大分子量蛋白沉淀，所以减少Transfer buffer中甲醇百分比（10％或更低）来避免这种情况发生，并添加SDS至终浓度为0.1％，进一步确保蛋白质不会沉淀。

④ 转膜方式

转膜方式采用湿转法与半干转法（湿转获得条带更好，半干转转膜效率高） ，恒压40V电压，转膜60-90min，一般小于400KDa的蛋白都能转到PVDF膜上。转膜中间也可以通过换冰保证低温环境。

湿转法所需条件（仅供参考）

半干转法（仅供参考）

恒压40V电压，转膜60-90min，一般小于400KDa的蛋白都能转到PVDF膜上。恒流法转，电流大小设置为PVDF膜的面积，转1h左右即可，若怕转膜过头，可以尝试将2张PVDF膜重叠起来（总会有一张膜上有条带）。

⑤ 增加转印时间

在正确的选择完凝胶、转印膜及转移buffer后，转印正式开始。因为大分子蛋白转移时间很慢，推荐350-400mA转移90min或 4°C；40mA，转印过夜。

⑥ 成功结果图分享

5）其他建议

① 转膜结束后，可以使用丽春红染液染膜，检验转膜效率；如果染色后无条带，则需考虑样品问题及转膜问题，进行调整。

② 因为多数大分子蛋白是膜蛋白，表达较少，建议适当增加上样量，并延长一抗孵育时间。

③ 大分子蛋白与PVDF膜的结合不是很牢固，容易脱落，洗膜时要操作轻柔，不要过于粗暴，否则抗原抗体复合物容易脱落。

6）案例分析

p300蛋白是一种重要的转录调节蛋白，大小为300kDa左右，被称为组蛋白乙型丙酮乙酸转移酶，是胞浆酶的一种。（p300在细胞核中发挥重要作用，参与许多细胞核过程的调节，包括基因转录、DNA复制、DNA修复以及细胞增殖和分化等。）

实验分析：上样量较多，分离胶浓度过高，跑胶以及转膜时间短等原因导致目标位置没有条带

7）常见问题&解析

① 蛋白质迁移不完全或迁移位置不准确

a.可能是由于电泳条件不当，如电流过高或时间过短，可以尝试调整电流和时间。

b.可能是由于堆积的蛋白质太多，可以尝试减少加载样品的量。

c.可能是由于蛋白质的大小超过了膜的迁移范围，可以尝试使用更大的膜或调整电泳条件。

② 背景信号过高

a.可能是由于非特异性结合，可以尝试增加非特异性结合抑制剂，如牛血清白蛋白（BSA）。

b.可能是由于过度的洗涤步骤，可以尝试减少洗涤次数或时间。

c.可能是由于次级抗体的过度使用，可以尝试减少次级抗体的浓度或使用更高质量的次级抗体。

③ 信号弱或无信号

a.可能是由于蛋白质的浓度过低，可以尝试增加加载样品的量。

b.可能是由于抗体的浓度过低，可以尝试增加抗体的浓度。

c.可能是由于抗体的选择不当，可以尝试使用其他抗体。

d.可能是由于蛋白质的修饰或结构导致抗体无法识别，可以尝试使用其他抗体或改变实验条件。

④ 带状模糊或分辨率不佳

a.可能是由于样品的净化不充分，可以尝试使用更高纯度的样品。

b.可能是由于电泳条件不当，如电流过高或时间过长，可以尝试调整电流和时间。

c.可能是由于缺乏还原剂或变性剂，可以尝试添加还原剂和变性剂。

⑤ 重复性差

a.可能是由于实验操作不一致，可以尝试标准化实验操作步骤。

b.可能是由于实验条件不稳定，可以尝试使用更稳定的实验条件。

c.可能是由于实验仪器的问题，可以尝试检查和维护实验仪器。

三、小分子蛋白实验步骤优化

1）凝胶上样、电泳

① 上样量

通常WB实验中每孔上样量为30-50μg，80%蛋白在细胞中的含量很低，当蛋白分子量过小时，上样量建议选择50-100μg。毕竟对于小分子的蛋白来说，在跑电泳时，稍不留心，蛋白就跑没影了。

② 凝胶浓度选择

分子量越小的蛋白，需要的凝胶浓度越高，反之亦然。

如果是商品化的凝胶试剂盒通常各个厂家针对不同的浓度的凝胶都有对应推荐用于分离的蛋白分子量，操作的时候仔细看说明书即可。

▲选择合适胶浓度，分子量小的蛋白，建议配置5%的浓缩胶。通常建议分子量小于10KDa的，选择15%的凝胶或Tricine-SDS-PAGE胶进行跑胶，10-15KDa的选择13.5%的胶，15-25KDa的选择12%的胶。

为什么小分子蛋白要搭配高浓度凝胶？

1）SDS-PAGE电泳是根据蛋白分子本身的大小来分离的。分子量越小，在电场下迁移的速度越快。

2）高浓度凝胶中的丙烯酰胺链条更紧密，间隙更小，能更好地分离不同大小的蛋白分子。低浓度凝胶间隙较大，小分子蛋白很难分离开来。

3）高浓度的凝胶可以提供更高的电场强度。这对于快速移动的小分子蛋白来说，可以延长其在凝胶中的停留时间，更有利于分离和检测。

4）高浓度凝胶的聚合度更高，也可以增加小分子蛋白在凝胶中的电泳时间，提供更好的分辨率。小分子蛋白所能结合的SDS较少，在蛋白向前迁移的过程中会向四周弥散，导致蛋白弥散。

5）还可以适当增加浓缩胶占整块胶的比例和浓缩胶的浓度，使蛋白样品在浓缩胶中充分聚集、压平，有利于蛋白的分离。

③ 电泳电压

电泳电压太大会导致跑在最前面的小分子蛋白成锯齿状，建议浓缩胶用80V 30分钟，之后调成100V, 溴酚蓝跑到距胶底1cm以上就停下，不要跑到底，否则目的蛋白可能跑出去了。

2）转膜

① 膜的选择

针对不同分子量的蛋白质，PVDF 膜有两种规格：0.45 μm 的膜适合检测 MW ＞ 20 kDa 的蛋白质，0.22μm 的膜适合检测MW ＜ 20 kDa 的蛋白质，而且0.22μm 的膜可以有效防止蛋白质在转移过程中直接穿透过膜。

也有说0.22μm的膜大小分子通用，小分子不用担心转过，大分子不用刻意延长转膜时间，根据经验，通常按常规250-300mA，1KDa/分钟，都能转上。

经验分享：PVDF 膜使用之前需要在甲醇中浸泡 5min 后再转入转移液中，这样操作可以活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合。

② 转膜方式

这里建议采用湿转的方式进行，转膜液不用添加SDS，可以添加10-20%的甲醇。

为什么要添加甲醇？

1）增强凝胶的交联度。高浓度凝胶的聚丙烯酰胺链会更紧密，孔隙更小，这有利于分离小分子蛋白。甲醇可以促进聚丙烯酰胺之间的交联，形成更紧密的三维网络结构。

2）减慢电泳速度。甲醇作为共溶剂，可以增加凝胶内部的粘度，从而降低电泳时蛋白分子在凝胶内的移动速度。这对于快速移动的小分子蛋白更有利于分离和检测。

3）防止蛋白聚集。高浓度凝胶电泳时，小分子蛋白容易聚集在一起，影响分离效果。甲醇可以防止蛋白之间的非特异性相互作用，减少聚集。

4）提高蛋白转移效率。甲醇可以增加转膜时蛋白与PVDF膜间的亲和力，有利于小分子蛋白从凝胶完全转移到PVDF膜上，提高检测敏感性。

③ 转膜电压、电流、时间控制

对于小分子蛋白，还应注意控制转膜的电压电流和时间。电流不宜太高，转膜时间不能过长。具体分子力量对应的转膜条件可参考下图。

3）抗体孵育

① 一抗稀释比例的选择

通常抗体的说明书上都会给出一定的稀释比例，对于分子量过小的蛋白来说，一抗应选择低一点的稀释比例，这样有助于抗体的结合。 

​4）显影

显影时需要根据信号的强弱适当调整曝光时间，如果在暗处马上可以看到条带，建议曝光时间在30s-2min内完成；如果信号较弱，第一遍滴加显影液后条带不会很清晰，可以把膜拿出来放一边让它反应一会，然后再放回机器里面，重新滴加显影液显影，效果就会好不少；还可以尝试适当延长显影时间，就能获得清晰的条带。 

5）案例分析

IL-8蛋白（interleukin-8 protein）是一种促炎性细胞因子，大小约为11kDa，通常由许多细胞产生，包括巨噬细胞、内皮细胞和上皮细胞等。IL-8在免疫应答中发挥关键作用，包括诱导中性粒细胞等免疫细胞向炎症部位迁移，并刺激这些细胞的激活。

经验分享：上样量较少，分离胶浓度过低，跑胶以及转膜时间长等原因导致目标位置没有条带，同时因为曝光时间过高出现较为严重的杂带，背景也明显变深。

6）常见问题&解析

① 如何确定样本中靶标蛋白的表达量

可以通过The Human Protein Atlas、GeneCards、BioGPS等数据库查询。很多小分子蛋白需要适当刺激才能诱导表达，所以实验前尽量做好充分的文献调研。

② 样本制备小tips

在样本制备过程中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂，防止蛋白降解；在制样过程中增加超声处理，尽可能的充分裂解样品，暴露抗原表位；以及尽量使用新鲜样本进行实验。

③ 如何避免小分子蛋白由于弥散拖尾现象

最好还是保留3个以上marker，或者做全膜，避免蛋白被裁去。

7）相关文献推荐

▲Tricine-SDS-PAGE是一种可用于分离极疏水蛋白质以进行质谱鉴定的蛋白质组学工具，可用于分离1-100kDa之间的蛋白质，是分离小于30 kDa蛋白质的首选电泳系统。凝胶中使用的丙烯酰胺浓度低于其他电泳系统，这对疏水性蛋白质尤为重要，因为大多数小分子蛋白是疏水性的。

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