底物显色通常实验操作的最重要的一步。显色的标记方式有生物素标记、地高辛标记、各种酶标记等，酶标的底物又有各种生色底物、化学发光法底物和荧光底物可供选择，显色方法多种多样，下面我们针对常用的几类方法进行总结对比分析，供大家方便在以后实验中根据自己需求进行选择。
酶促反应较生物素安全且反应快速，是WB中的主流显色方法。酶促反应根据不同底物显色方法又包括化学发光和底物显色。化学发光法灵敏度高，可以达到pg级，而底物显色由于直接显色而操作简单且成本低。最为大家所熟悉的底物显色当数HRP(辣根过氧化物酶，Horseradish Peroxidase)和AP(碱性磷酸酶，Alkaline Phosphatase)。
一. HRP(辣根过氧化物酶，Horseradish Peroxidase)
这是最常见的酶促发光或显色的交联酶，由于HRP比活高、分子量小、特异性强、稳定性好和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。HRP的底物主要包括生色底物和化学发光底物两大类，对于底物的选择，主要考虑的是灵敏度、背景和使用的方便性和稳定性。
1.HRP 生色底物
生色底物显色主要是利用底物在有HRP和H2O2的存在下失去电子而呈现出颜色变化积累这一过程检测WB的结果。生色底物主要包括DAB、4-CN、CN/DAB、AEC和TMB等。下面对这4种生色底物从不同方面进行比较。其中，DAB应该是最熟悉的底物，灵敏度高，特异性好，缺点就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，而且有毒。4-CN反差大容易拍照，可与DAB联用。TMB的信噪比高，成分安全，特别合适于灵敏度要求高的WB，但是也要避免由于灵敏度高而引起的高背景，因此可以相应的延长封闭的时间和注意洗涤的次数。AEC各方面性质与DAB相似，但灵敏度要差一点。
1.2 HRP 生色底物比较
1.3 HRP 生色底物介绍
氨基联苯胺(3，3-diaminobenzidine，DAB) 是过氧化物酶的显色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而星现出颜色变化和积累，形成棕褐色不溶性产物，并就地原位沉淀。DAB显色反应原理如下:
HRP +H202+DAB→HRP + H20 +氧化型DAB↓
捷倍斯生产的DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒（DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit-GBCBIO-G3433）经过改良配方，AB液等体积混合即可，可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可以用于 Western等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。同时也可以用于细胞或组织内源性的辣根过氧化物酶显色。
2. HRP 化学发光底物介绍
化学发光底物最常用的是鲁米诺（Luminol），化学发光法由于仅在酶和底物都存在的时候才会发光，不同于生色反应，所以特别适合在同一张膜上对不同的目标蛋白分别进行多次检测。ECL几乎成为化学发光法的代名词，一般含有鲁米诺、H2O2和发光增强剂等物质。发光试剂中的鲁米诺被HRP和H2O2氧化，产生荧光，这个过程被发光增强剂加强。其中，增强剂在体系中扮演着核心角色，决定着ECL化学发光的发展。化学发光的常见问题主要是抗体浓度过高，所以抗体用量要比规定的稀释倍数放大，确保不会因为HRP过量导致底物过快消耗完而引起结果不稳定。
捷倍斯生物公司生产的超敏ECL发光液(SuperEnhanced ECL-GBCBIO-G3308)，与Pierce产的灵敏度相当，背景小，可与二抗上耦连的辣根过氧化物酶发生化学反应，发出荧光，从而可以通过用X光片压片或其它适当荧光成像设备检测样品。超敏ECL化学发光试剂灵敏度高，比DAB显色的灵敏度至少高1000倍，比Pierce公司的SuperSignal West Pico Substrate的灵敏度高10倍，对于辣根过氧化物酶的检测灵敏度可以达到飞克级。
二. AP(碱性磷酸酶，Alkaline Phosphatase)
1. AP显色底物
AP作为一种经典常用的显色交联酶，自有其优点，如AP的底物显然更稳定。AP显色的灵敏度已经可以达到低pg级，但前提是封闭要做得好。常用的AP包括BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐）、NBT（四唑硝基蓝）和INT（硝基四紫唑），以及它们之间的组合使用。
1. 1 AP显色方法比较
这其中，BCIP/NBT是碱性磷酸酶最佳的底物组合之一，其灵敏度最高，显色比较锐利，成像性也比较好，因此最常被用到。
1.2 常用AP显色底物介绍
NBT+BCIP是碱性磷酸酶最佳的底物组合之一。在碱性磷酸酶(AP)的催化下，BCIP会被水解而产生强反应性产物，该产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色化学物。该试剂盒可用于碱性磷酸酶系统的IHC和WB实验的酶促显色。在AP的催化下，在组织切片或印迹膜上结合了AP偶联物的地方产生深蓝色沉淀，可根据颜色反应来确定目的蛋白的位置及表达情况。
捷倍斯生物生产的BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒(BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit-GBCBIO-E1161)可用于免疫组化显色、Western等膜显色等的试剂盒。BCIP/NBT是碱性磷酸酯酶的常用底物。在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。
三. 常用三种显色方法对比
我们知道ECL,DAB,NBT/BCIP是比较常用的三种显色方法，其中ECL和DAB都是HRP的底物，NBT/BCIP的酶是碱性磷酸酶。而目三者的颜色显示不同，DAB的显色是棕褐色，NBT/BCIP显蓝色，ECL显荧光。在灵敏度方面，ECL化学发光的灵敏度最高，为1~5pg，也有达到fg级的，BCIP/NBT的灵敏度100pg，DAB的灵敏度最低，大约为500pg。在试验中进行选择时，可根据不同的酶以及灵敏度等进行选择，并且注意操作时应佩戴手套，避免将显色剂与皮肤接触，用后及时彻底冲洗。
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