文献概述：

    本文阐述了一种名为MAJESTIC的创新基因传递系统，该系统由mRNA编码的Sleeping Beauty转座酶和腺相关病毒（AAV）编码的Sleeping Beauty转座子组成，旨在工程化治疗性免疫细胞。该系统通过AAV介导的mRNA转座酶和转座子，实现了基因的稳定整合。与慢病毒载体和转座子DNA或微环DNA电穿孔相比，MAJESTIC系统提供了更长的转基因表达时间、更高的转基因表达水平、治疗性细胞产量和细胞活力。

    该系统适用于T细胞、自然杀伤细胞、髓样细胞和诱导多能干细胞的工程化，并可传递双特异性CAR、开关CAR和合成T细胞受体。此外，MAJESTIC系统还可用于工程化iPSCs，以生成各种治疗性免疫细胞。

    综上所述，MAJESTIC系统是一种高效、安全且灵活的基因传递系统，适用于多种免疫细胞类型的工程化，为细胞治疗和基因治疗领域开辟了新的可能性。

这篇题为：“AAV-mediated delivery of a Sleeping Beauty transposon and an mRNA-encoded transposase for the engineering of therapeutic immune cells”的研究成果于2023年7月10日发表于《Nature》上。

（图片来源：nature）

    关键词：

    基因治疗、免疫细胞工程、腺相关病毒、mRNA、嵌合抗原受体、免疫疗法

    正文内容：

    实验设计：

    1.基因传递系统开发：研究人员开发了一个结合mRNA、AAV载体和转座子的复合基因传递系统，称为MAJESTIC。该系统包括编码Sleeping Beauty（SB）转座酶的mRNA和包含目标基因的AAV-SB转座子。

    2.CAR T细胞生成：研究人员使用MAJESTIC系统生成CAR T细胞，并与慢病毒载体和DNA转座子系统进行比较。他们测试了不同浓度的AAV-SB-CAR病毒和SB100X mRNA对T细胞转导效率的影响，并优化了转导条件。

    3.细胞活力和基因表达稳定性：通过流式细胞术和定量PCR等方法评估了不同基因传递系统对T细胞活力和CAR基因表达稳定性的影响。

    4.功能验证：研究人员通过体外肿瘤杀伤实验和体内小鼠模型实验验证了MAJESTIC系统生成的CAR T细胞的功能。

    5.多免疫细胞类型应用：除了T细胞，研究人员还测试了MAJESTIC系统在其他免疫细胞类型（如NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞）中的应用，以及在不同基因（如双特异性CAR、TCR和自杀基因CAR）传递中的应用。

    6.与MC DNA系统的比较：研究人员将MAJESTIC系统与另一种非病毒基因传递系统（MC DNA系统）进行了比较，以评估其效率和安全性。

    7.基因组整合分析：通过插入位点测序和分析，研究人员评估了MAJESTIC系统在T细胞中的基因组整合情况。

（图片来源：nature）

（图片来源：nature）

    实验方法：

    1.构建AAV-SB-CAR载体：研究人员首先构建了包含所需细胞治疗转基因的AAV-SB载体，然后将单链抗体片段可变区（scFv）等CAR构建插入到AAV-SB载体中。

    2.制备mRNA：使用体外转录的方法从SB100X质粒中制备编码SB转座酶的mRNA。

    3.细胞培养：使用各种人源细胞系（如T细胞、NK细胞、巨噬细胞等）进行实验。

    4.基因转移/CAR递送：使用电穿孔的方法将mRNA和AAV-SB-CAR载体递送到目标细胞中，实现基因的稳定整合。

    5.流式细胞术分析：使用流式细胞术检测CAR的表达水平、细胞活力等。

    6.杀伤实验：通过共培养CAR T细胞和肿瘤细胞，评估CAR T细胞的杀伤活性。

    7.插入位点分析：使用插入位点测序的方法分析AAV-SB-CAR载体在基因组中的整合情况。

    8.体内实验：使用NOD-scid IL2Rgammanull小鼠模型，评估CAR T细胞在体内的抗肿瘤活性。

（图片来源：nature）

（图片来源：nature）

（图片来源：nature）

    实验材料：

    1.细胞系：研究人员使用了多种细胞系，包括HEK293T、NALM6、MM.1R、MCF7、NK-92、THP-1、人CD14+单核细胞、人外周血单个核细胞（PBMCs）和人诱导多能干细胞（iPSCs）。

    2.病毒载体：研究人员使用了腺相关病毒（AAV）和慢病毒作为基因传递载体。AAV用于构建AAV-SB-CAR载体，而慢病毒用于基因转导。

    3.质粒和转座子：研究人员使用了AAV-SB质粒、SB转座子和SB100X转座酶质粒等。AAV-SB质粒用于构建AAV-SB-CAR载体，SB转座子用于基因插入，SB100X转座酶质粒用于转座子的活化和插入。

    4.试剂和抗体：研究人员使用了各种试剂和抗体，包括CD22-Fc蛋白、BCMA-Fc蛋白、抗人IgG Fc-APC抗体、抗Flag抗体、APC streptavidin、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28等。

    5.仪器设备：研究人员使用了各种仪器设备，包括流式细胞仪、电穿孔仪、PCR仪、凝胶电泳仪等。

    实验结果：

    1. MAJESTIC系统能够高效地将嵌合抗原受体（CAR）基因整合到T细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）、髓样细胞和诱导多能干细胞（iPSCs）中，并表现出高细胞活力和产量。

    2. 与慢病毒载体和DNA转座子系统相比，MAJESTIC系统能够提供更长的转基因表达时间，更高的转基因表达水平，治疗性细胞产量和细胞活力。

    3. MAJESTIC系统能够生成针对不同肿瘤抗原的单特异性CAR和双特异性CAR，并显示出在体内外对肿瘤细胞的杀伤活性。

    4. MAJESTIC系统在多种免疫细胞类型中表现出通用性，包括T细胞、NK细胞、髓样细胞和iPSCs，表明该系统可以广泛应用于免疫细胞治疗。

    5. MAJESTIC系统与传统的DNA转座子/转座酶系统（如PiggyBac和MC系统）相比，具有更高的细胞活力和转基因表达效率。

    6. 通过对插入位点的分析，MAJESTIC系统介导的基因整合倾向于安全港区域，与慢病毒介导的整合相比，具有更高的安全性。

    7. 整体而言，MAJESTIC系统提供了一种高效、安全且通用的方法，用于生成用于免疫治疗的基因工程免疫细胞。

（图片来源：nature）

（图片来源：nature）

结论：

    本研究详细阐述了MAJESTIC这一创新的基因传递系统。该系统融合了mRNA、AAV载体以及Sleeping Beauty转座子的优势，旨在高效生成治疗性免疫细胞。通过AAV载体传递含有目标基因的Sleeping Beauty转座子，同时利用mRNA电穿孔技术递送编码转座酶的mRNA，从而实现转座子在基因组中的整合。

    相较于慢病毒载体、转座子DNA或微环DNA的电穿孔方法，MAJESTIC系统展现出更长的转基因表达时间、更高的表达水平、更高的治疗性细胞产量以及更佳的细胞活力。该系统可应用于向T细胞（体内实验表明其具有显著的抗肿瘤活性）、自然杀伤细胞、髓样细胞以及诱导多能干细胞传递嵌合抗原受体（CARs）、双特异性CARs、开关CARs和合成T细胞受体。

    此外，MAJESTIC系统还可用于多种免疫细胞类型的治疗性细胞工程，包括T细胞、NK细胞、iPSCs和髓样细胞系。综上所述，MAJESTIC系统是一种高效、安全且灵活的治疗性免疫细胞生成方法，为细胞免疫治疗领域带来了新的机遇。

    原文：

    https://www.nature.com/articles/s41551-023-01058-6