细胞增殖检测是细胞学实验中基础且重要的实验，是细胞功能检测的一环。上期我们介绍了细胞增殖检测常见方法的原理及优缺点，包括细胞计数法、MTT法、CCK-8法、EdU和BrdU法。本期我们整理了细胞计数法、CCK-8法、EdU和BrdU法的实验操作步骤及相关注意事项，供大家参考。

一、细胞计数法

实验步骤：

  1. 将计数板及盖玻片清洗干净，晾干；

  2. 用PBS洗涤细胞，常规消化细胞后离心收集；

  3. 加入适量培养基重悬细胞，轻轻吹打，制备单细胞悬液；

  4. 吸取约10μL的细胞悬液，滴加到计数板上，注意盖玻片和计数板间避免出现气泡；

  5. 静置1-2min待细胞沉降；

  6. 在显微镜下进行人手动计数，或将计数板置于自动计数仪中计数

  7. 在实验的不同时间点进行计数，记录每次计数结果，绘制细胞增殖曲线，比较不同处理组间的细胞增殖速率。

  8. 计数区域及规则：

（1）区域：计数板中有多个计数室，通常选择计数板的四角处的四个大格进行计数；

（2）规则：只对完全位于小格内的细胞进行计数；对于压线的细胞有两种计数方式，一是采用“数左不数右，数上不数下”的原则，即只计数压在左边和上边线上的细胞，而不计数压在右边和下边线上的细胞。二是采用“数双线内不数外”的原则，即只计数压在两条相邻小格线之间的细胞，不计数只压在一条线上的细胞。

  9. 细胞数量计算公式：细胞数/mL=（四个大格内细胞总数/4）×10^4

（乘以10^4是因为一个大格的体积是0.1mm^3）

图1 细胞计数板示意图（来源于网络）

注意事项：

  1. 消化细胞时一定要消化完全，以便制备单细胞悬液，同时注意避免消化过度；

  2. 出现细胞团块，应按单细胞计算；若细胞团较多，说明消化或重悬不够充分，应分散细胞后重新取样计数；

  3. 每个大方格至少要有20-50个细胞，若明显过多或过少说明稀释不当，应该重新稀释；

  4. 计算细胞数时，如果上样前对细胞悬液进行过稀释，则还需乘上相应的稀释倍数，即：

       细胞数/mL=（四个大格内细胞总数/4）×稀释倍数×10^4

  5. 收集后的细胞应尽快进行计数，以免细胞发生显著的生物学变化。

二、CCK-8法

实验步骤：

  1. 细胞接种：在96孔板中接种细胞悬液（100 μl/孔），每组细胞设置多个复孔。将培养板放入培养箱中培养至合适的密度（37℃, 5% CO2）；

  2. 细胞处理：按照实验设计给予细胞不同处理，如药物或培养条件变化；

  3. 细胞培养：将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）；

（注：2和3为细胞毒性检测所需，若是细胞活性检测可直接由1跳至4）

  4. 添加CCK-8试剂：向每孔加入10 μl CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，会影响OD值的读数）。

  5. 细胞孵育：将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

  6. 吸光度测定：用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

  7. 若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μl 0.1 M的HCl溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。

  8. 数据分析：计算各处理组相对于对照组的细胞增殖率（如通过归一化OD值或计算抑制率），绘制曲线，分析细胞增殖的动态变化及不同处理的影响。

图2 CCK-8结果参考图（DOI：10.1111/jpi.12935）

注意事项：

  1. 建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。

  2. 有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入CCK-8试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，会干扰OD值读数。

  3. 白细胞可能需要培养较长时间。

  4. 当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8 溶液。

  5. 如果没有450 nm的滤光片，可以使用吸光度在430-490 nm 之间的滤光片，但是450 nm滤光片的检测灵敏度最高。

  6. 培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

  7. 实验过程中避免光照，防止CCK-8反应受光影响。

  8. CCK-8法不适合用于检测含有还原剂或色素的样品，这些因素可能会干扰吸光度测定。

三、EdU检测法

实验步骤：

  1. 细胞的准备与处理同CCK-8，培养板可选择96孔板、48孔板、12孔板和6孔板等（这里以96孔板为例）；

  2. 用完全培养基将EdU稀释为20μM的工作液，向96孔板中加入100μL EdU工作液，使其浓度为10μM，该浓度适用于大部分细胞；

  3. 将细胞置于37℃培养箱中孵育适当时间（约2h）；

  4. 完成标记后，去除培养基，用PBS洗涤1-2次；

  5. 每孔加入50μL 4%多聚甲醛固定细胞10-15min；

  6. 去除固定液，PBS洗涤细胞3次，每次3-5 min；

  7. 每孔加入100μL通透液（含Triton X-100的PBS），室温孵育10-15min；

  8. 去除通透液，PBS洗涤细胞1-2次，每次3-5 min；

  9. 根据EdU反应检测试剂盒说明进行荧光标记；有需要可同时使用DAPI等核染料进行细胞核染色；

  10. 通过荧光显微镜、共聚焦显微镜或流式细胞仪等检测有荧光标记的EdU阳性细胞，计算其占细胞总数的比例，以评估细胞增殖水平。

注意事项：

  1. EdU孵育时间应根据细胞周期长度和增殖速度适当调整；

  2. 确保染色过程严格避光，以保护荧光信号；

  3. 根据实验需求选择合适的荧光，避免撞色；

  4. 稀释EdU需使用完全培养基，使细胞保持正常的增殖状态。

四、BrdU检测法

实验步骤：

  1. 常规接种细胞和预处理，并确保细胞处于对数生长期；

  2. 按说明书参考浓度向培养体系中加入BrdU，置于培养箱中孵育适当时间（如2h左右）；

  3. 去除培养基，用PBS洗涤细胞，并固定和透化（同EdU第4-8步）；

  4. 加入细胞变性液进行约70℃、30min的热处理，以暴露BrdU抗原位点；

  5. 进行常规的BrdU一抗和荧光二抗孵育；有需要可同时使用DAPI等核染料进行细胞核染色；

  6. 通过荧光显微镜或流式细胞仪检测BrdU阳性细胞。

注意事项：

  1. BrdU具有光敏性，且不稳定，因此实验过程需要避光和现配现用；

  2. BrdU具有毒性，使用过程注意防护；

  3. BrdU抗体需要根据实验目的选择合适的类型。

       以上就是细胞增殖检测实验方法的操作步骤，具体细节可以详细参考所用试剂说明书。下期我们将介绍另一个细胞功能实验—细胞凋亡，它的重要性和普遍性不亚于细胞增殖，也是印证细胞增殖水平的另一重要指标。感兴趣的小伙伴欢迎继续关注~