规划高效的CRISPR筛选始于针对感兴趣的基因或位点的sgRNA文库的设计。然后合成与sgRNA设计相对应的寡核苷酸池，并将其克隆到载体中以表达sgRNA，或转录成RNA以在将进行筛选的细胞系统中转染。

合理、高效的sgRNA文库设计是进行基因组/代谢通路编辑的重要前提，sgRNA文库结合高通量筛选技术在药物研发、基因功能研究、分子诊断、疾病治疗和作物育种等领域均发挥重要的作用。

CRISPR文库构建及其下游工作

sgRNA文库的类型

gRNA文库包括：全基因组文库、lncRNA文库、信号通路、细胞凋亡、细胞增殖、离子通道、核受体相关、各种疾病相关等文库。

全基因组gRNA文库的构建可以针对任何类型的基因组DNA，包括ORF cDNA，lncRNA cDNA以及特定区域的cDNA片段等。能够针对全长cDNA乃至基因组DNA构建高效的gRNA文库，适用于高通量功能基因及相关药物靶点筛选。

使用软件设计CRISPR sgRNA

一旦选择了目标基因和Cas核酸酶，下一个重要步骤就是设计特定的指导 RNA 序列。有几种软件工具可用于设计具有最小脱靶效应和最大靶向效率的最佳指南。以下工具是最流行的向导 RNA 设计工具。

sgRNA设计的重要考虑因素和限制因素

在为CRISPR实验设计sgRNA时，应该考虑几件事：

• sgRNA的GC含量很重要，因为较高的GC含量会使其更稳定——它应该是40-80%。

• sgRNA的长度应在17-24个核苷酸之间，具体取决于您使用的特定Cas核酸酶。较短的序列可以最大限度地减少脱靶效应，但是，如果序列太短，也会发生相反的情况。

• gRNA和目标站点之间的不匹配会导致脱靶效应，具体取决于不匹配的数量及其位置。

• 由于活性和特异性可能无法预测，因此可能需要为每个感兴趣的基因设计多个sgRNA。

高通量sgRNA文库筛选

高通量sgRNA文库筛选是用全基因组或特定通路的sgRNA文库在指定细胞内通过功能性筛选、富集以及随后的PCR扩增和深度测序分析，挖掘与表型相关的基因或在全基因组范围内筛选药物新靶点。CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选大体流程分为五步，即gRNA文库选择，gRNA文库扩增，gRNA文库慢病毒包装，gRNA文库筛选，PCR扩增和NGS测序。常用的筛选技术包括CRISPR敲除筛选，激活筛选，抑制筛选。

高通量sgRNA文库筛选流程

CRISPR敲除筛选

在CRISPR-Cas9的作用下通过NHEJ或HDR进行全基因组不可逆基因消融，然后筛选由此产生的表型改变。

CRISPR激活筛选

通过CRISPR-dCas9在不扰乱基因组序列的情况下进行全基因组可逆基因激活，通常采用额外的调控域，然后筛选由此产生的表型改变。

CRISPR抑制筛选

CRISPR-dCas9在不扰乱基因组序列的情况下进行全基因组可逆基因抑制，通常采用额外的调控域，然后筛选产生的表型改变。

CRISPR 筛选的类型

CRISPR筛选设计

药物压力筛选法。通过高通量测序，比较对照组与实验组之间sgRNA种类的差异及丰度变化，确定基因敲除对细胞耐受药物或敏感性的影响。

细胞分选法。利用FACS筛选出所需的细胞类群，并比较不同类群细胞之间sgRNA丰度，以达到功能性sgRNA的筛选目的。

单细胞CRISPR筛选法。将CRISPR筛选与单细胞转录组测序(scRNA-seq)相结合，以探索基因功能和遗传调控网络。

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