近年来，ATAC-seq已经成为探测染色质结构的一项流行技术。ATAC-seq的操作相对简单，不需要繁琐的建库步骤，可以直接生成待测序的文库，帮助研究人员检测染色质开放情况，核小体以及转录因子的定位。虽然测序技术已经有了很大的进展，但是测序成本相对来说还是比较高昂的，那么如何对ATAC-seq文库进行质量控制从而保证数据质量呢？很多研究人员对于ATAC-seq文库的质控并不是很清楚。我们最常被问到的问题之一就是我的ATAC-seq文库质量怎么样？在此，我们分享一些经验，来帮助您分析您的文库。
ATAC-seq 可简要归纳为五个步骤：样本通透化处理、转座反应、文库制备、上机测序以及生信分析。通常ATAC-seqQC是指在生信分析前期对于数据质量的控制，但是由于测序成本相对来说还是比较高昂的，在送测序前对文库进行质控可以节约测序的时间和成本，我们把ATAC文库的质控分为两个部分，测序前以及生信分析前期，来帮助研究人员们更好的把控ATAC-seq数据的质量。
一、测序前的质量控制
下面是关于测序前质控的一些经验。ATAC-seq文库的QC步骤主要包括检测文库的片段分布和浓度。其中最重要的指标是文库的分布情况，但是值得注意的是，ATAC文库分布情况受多种因素干扰，它只应被视为一个是否值得继续进行测序的指标。
1.1.文库的浓度
ATAC-seq实验推荐的起始细胞量是1-10万个细胞，转座反应后，PCR扩增的循环数在10-13个循环，我们不推荐太多的循环，因为过多的循环不仅会导致产生大量的引物二聚体，更会产生过多的重复文库片段。考虑到不同样本的染色质开放程度略有不同，另外样本的新鲜程度不同，这会导致最后得到的文库浓度有所不同，一般文库浓度在1-20 ng/uL。但最后得到的文库浓度低并不意味着ATAC-seq实验失败，因为ATAC-seq文库的浓度受多种因素制约。
现在测序技术取得了巨大的发展，低至3 nM的样品都可以上机测序得到高质量数据，因此不必因为DNA产量低而担心自己的实验失败了。另外，如果最后得到的DNA浓度只有几ng/uL，实验室通用的NanoDrop仪器对于这样的微量DNA浓度是测不准的，我们推荐使用赛默飞公司的Qubit仪器对文库进行定量。
1.2.文库的分布
ATAC-seq实验的文库的大小分布情况是QC检验的重要指标。在真核生物的染色质中，核DNA被包装在核小体中，每个核小体含有147 bp的DNA，缠绕在组蛋白八聚体核心周围，每个核小体之间有20-90 bp的短DNA接头。染色质这种紧密或松散的包装可以控制基因是否表达——在DNA与组蛋白缠绕比较松散或开放的染色质区域，转录启动子和增强子可以触及到DNA，从而可以进行转录；在DNA与组蛋白紧密结合或封闭的染色质区域，启动子和增强子区会被隐藏起来，这种情况下转录因子就无法激活转录。
ATAC-seq实验是基于负载了接头的Tn5可以优先进入开放染色质DNA，在DNA中切割并插入接头这一原理设计的。Tn5对DNA的切割可能发生在核小体20-90 bp连接区域的任何位置，可能在核小体连接区域切割产生<90 bp的小片段或者将一个或多个核小体夹在中间切割产生的较大片段。另外，在切割后，原始的DNA切割片段两端会被添加上P5/P7 Illumina流通接头（adapters）和索引序列（index），这一部分约135 bp。这种切割模式反映在ATAC-seq文库DNA片段的大小上。ATAC-seq文库片段将从200 bp左右开始出峰，且由于切割到的核小体个数不同，堆积出多个峰，峰相距160-200 bp，一直到1000bp左右为止。可以参考以下的分布图：
图1：典型成功的 ATAC-seq 文库分布图（BioAnalyzer 2100）
由于样品类型、细胞数量和实验过程中的差异，ATAC-seq文库的大小和形状可能会有很大差异，包括核小体峰的数量也可能会有所不同。一个成功的ATAC-seq实验的片段分布如图1a所示。在该图中我们可以看到有单核小体、双核小体、三核小体这样依次累计下去，并且呈现向下的阶梯状模式。图1b的核小体分布并不是很明显突出，即“滑雪坡”模式，这可能是由于过度转座导致，但也有可能由于存在线粒体基因组片段的污染，并不一定影响核基因组中开放染色质的富集。
图2：典型失败的 ATAC-seq 文库分布图（BioAnalyzer 2100）
如图2a文库存在的问题是片段过大，可能是细胞膜通透不完全或者说细胞过多，酶的量太少等原因导致的。图2b的文库分布没有检测到DNA，那么可能是在操作的过程中细胞或者DNA丢失，Tn5酶失活等原因导致的。
ATAC-seq 文库片段的分布会有所不同。即使每次使用都含有一致试剂的试剂盒，细胞数量、细胞裂解或特定组蛋白标记频率的微小变化也可能导致Tn5切割频率的差异。然而，即使切割频率存在这种差异，并由此导致了文库片段分布情况的差异，这些样品之间的测序数据质量仍然很稳定，因为数据峰值仍然主要取决于Tn5对开放染色质可及性。文库分布情况只应被视为一个是否值得继续进行测序的指标。
二、ATAC-seq质控
在测序完成拿到了测序数据后，要经过一些预处理，如FastQC可用于测序数据中碱基质量、GC 含量、序列长度分布、序列重复水平等指标的评估和过滤。接下来就是把数据比对映射到基因组上，在比对完成后，与大部分DNA测序数据一样，要对唯一映射读数及百分比等进行质控，如成功的ATAC-seq实验的唯一映射率应超过80%。ATAC-seq还有其他特定的质量指标需要评估：
a. 在已知染色质可及性区域中转座酶插入的富集（信噪比），
b. 片段大小分布
图3：典型成功的 ATAC-seq 片段分布
图4：典型成功的 ATAC-seq TSS富集图
如图3，去除接头后的ATAC-seq分布具有大约200 bp的明显周期性，表明片段受到核小体整数倍的保护。在200bp之下的是NFR区域，这种片段的分布呈现出细小的锯齿状，这和DNA螺旋间距相关。图4显示了ATAC-seq 的TSS富集情况，无核小体片段（Nucleosome Free Region, NFR）信号在TSS附近富集，而核小体信号则避开了TSS，在转录起始位点两侧显示出富集。有文献认为信噪比是ATAC-seq重要的质量控制指标，并通过TSS Score来评估ATAC-seq的信噪比。如图5所示，两个具有相似 TSS Score（分别为 8.3 和 8.8）的文库具有不同的分布，所以不能认为没有明显核小体峰图的文库是失败的，二者要综合来看；TSS Score为1.7的文库则只有很低的信号富集，显然是失败的实验。
图5. ATAC-seq TSS 富集和文库分布
我们希望这篇文章可以帮助研究人员了解ATAC-seq实验质控的一些关键细节，也期待各位研究人员使用ATAC-seq来解决更多的生物学问题。
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参考文献：
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