今天介绍的一篇来自Nature protocol的单细胞注释指南。这篇文章主要介绍如何解释单细胞数据，并识别细胞类型，状态和其他生物模式。通常采用三个步骤：自动细胞注释，手动细胞注释和注释验证。并分析了注释过程中常见的问题，以及应对策略。

研究背景

单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单核RNA测序可用于测量单细胞转录组，并绘制各种组织和生物体中的新细胞类型、状态和动态。单细胞转录组学数据通常以二维“图谱”的形式呈现，基于细胞基因表达谱的相似性来组织细胞。以这种方式可视化的数据识别高度相似的细胞组（或“簇”）。因此必须对这些簇进行解释和注释，以定义细胞类型和状态，从而支持生物发现。

下图分析工作流程展示了如何从组织中创建单细胞转录组图谱。首先组织被分解成单细胞，并使用单细胞转录组技术进行分析。然后使用计算分析对结果进行质量控制过滤（例如，去除低质量细胞），量化每个细胞中每个映射基因的表达，使用聚类算法识别相似细胞组，并使用t分布随机邻域嵌入（t-SNE）或均匀流形近似和投影（UMAP）等技术在二维中可视化所有细胞，以产生未标记的“单细胞图”图像。

为了从生物学上解释这张图，就有必要确定哪些细胞类型或细胞状态由数据中观察到的簇或其他模式表示。本教程提供了图谱解释和标记过程的指南，从聚类数据到生成完全注释的单细胞图谱。在scRNA-seq数据中注释细胞的一般工作流程有三个主要步骤：自动注释、手动注释和验证。首先，自动注释使用预定义的一组“标记基因”（即在已知细胞类型中特异性表达的基因）或参考单细胞数据（现有的专业注释的单细胞图谱），通过将单个细胞或细胞簇的基因表达模式（特征）与已知细胞类型的基因表达方式（特征）相匹配来识别和标记它们。第二个主要步骤是手动注释，包括研究每个细胞簇或模式特有的基因和基因功能，以验证自动细胞注释并识别新的细胞类型。

步骤1：自动细胞注释

自动细胞注释是使用计算机算法和适当的生物学知识来标记细胞或细胞簇的有效方法。一般原理是识别单个细胞或细胞簇中与已知细胞类型或状态的特征基因表达特征相匹配的基因表达信号（模式或特征），然后为集群分配相应的标签。有两种主要的自动注释方法：

一种是对待注释样本中发现的每种细胞类型使用已知的标记基因（称为“基于标记的自动注释”）。在这种情况下，标记基因和细胞类型之间的已知关系是从数据库中获得的，例如SCSig、PanglaoDB和CellMarker，或者从文献中手动获得。然后，细胞或簇根据其特征表达的标记基因进行标记。

第二种方法是将待注释的单细胞RNAseq数据（“查询”数据集）与现有的、相似的、经过专业注释的scRNA-seq数据集进行比较，并将标签从参考细胞或簇转移到查询中足够相似的细胞或簇（称为“基于参考的自动注释”）。参考单细胞数据从基因表达综合（GEO）、单细胞表达图谱或细胞图谱项目获得。

然而，并不是所有的细胞都能容易地分组成簇，尤其是对于动态系统，如发育中的组织或含有基因表达梯度的组织。因此，自动细胞注释主要用于快速识别已知细胞类型并突显未知细胞类型以供进一步探索。

1.基于标记的自动注释

基于标记的自动化注释基于已知标记基因的特征表达来标记细胞或细胞簇。为了标记单个细胞，最可靠的基于标记的注释工具之一是半监督类别识别和分配（SCINA）。SCINA假设每个标记遵循双峰基因表达分布，其中一个峰对应于相关细胞类型的细胞，而另一个峰包含实验中的其余细胞。假设特定类型的细胞在该分布的上部具有该细胞类型的所有标记物的表达，因此要求作为SCINA的输入提供的标记物仅对一种细胞类型特异。

基于参考的自动注释

基于参考的细胞注释基于“guilt by association”的概念，从而将参考数据中的细胞或簇标签转移到查询数据中具有相似基因表达谱的未标记细胞或簇。因此，只有当高质量和相关的注释参考单细胞数据可用时，这种方法才是可能的。

图1.自动注释结果取决于所使用的标记基因。

步骤2：专家手动注释

尽管自动注释方法方便且系统，但它们需要适当的参考数据库，并且并不总是高置信度注释。当这些方法导致置信度较低、细胞标签冲突或缺失时，需要专家手动注释。如果一个已知细胞类型的许多标记基因在集群中的细胞中高度表达，这通常足以支持它被标记为该细胞类型。此外，当没有任何单一的可区分的基因表达标记时，必须将多个基因一起用于区分数据中的细胞类型与其他细胞类型。细胞定义基因主要来源是相关生物体、器官和疾病背景的单细胞图谱。鉴于蛋白质表达可能与mRNA表达相关，可以从组织内染色模式的已发表证据（即使用免疫组织化学或免疫荧光）、流式细胞术和蛋白质印迹中收集蛋白质表达标记物并将其用作潜在的基因表达标记物。

一旦来自已知标记物的细胞类型信息耗尽，就必须逐簇手动检查未经自信注释的细胞。通过计算集群和所有其他细胞之间的差异表达来识别潜在的新标记（图2）。注释细胞状态和梯度在分析和表征新的细胞类型时，重要的是确定它们是代表稳定的细胞类型还是包含多个细胞状态。细胞类型和状态的定义尚未标准化，但稳定的细胞类型可以预期在整个簇中具有均匀的基因表达，而细胞梯度表现为细胞和细胞状态（例如，细胞周期状态）（图2）。表达梯度表示细胞群体中存在的连续差异，这可能代表细胞周期、免疫激活、空间模式或短暂发育阶段等状态。

一些细胞可能很难注释，包括新的细胞类型，这些细胞类型可以根据它们表达的基因的功能进行描述。此外，可能特别难以区分相同总体类型的组织驻留细胞（例如，组织驻留巨噬细胞）和非组织常驻细胞（例如在血液中循环的单核细胞）。鉴定组织驻留细胞的一种方法是修改实验设计，以通过灌注步骤从所述组织中去除过客细胞。然而，通过冲洗去除的细胞的数量和类型将取决于特定的组织和方案。

图2.如何识别和可视化细胞类型梯度。

第三步：注释验证

上述工具和方法可以为scRNA-seq数据提供可靠的细胞类型标记。由于信使核糖核酸测量仅部分定义了细胞类型和功能，因此必须通过实验验证有关新型细胞类型的重要结论。

标题：Tutorial: guidelines for annotating single-cell transcriptomic maps using automated and manual methods

译名：教程：使用自动和手动方法注释单细胞转录组图的指南

期刊：NATURE PROTOCOLS

影响因子：14.8

发表时间：2021.5.24

作者：多伦多大学