【准备阶段】

①NCBI查找目的基因序列信息，然后将序列信息导入“Snapgene”软件中

②选择实验室中有的，并且合适的载体，将目的基因构建到载体上。载体一般要具有多克隆位点、抗性基因、启动子等结构。多克隆位点上有可以选择的许多单一酶切位点。一般做克隆可以选择单酶切载体也可以双酶切载体，单酶切要注意防止载体自连，因此采取双酶切可以避免这个情况。

③利用“Snapgene”针对目的基因序列设计特异性引物，设计引物要带上酶切位点，酶切位点选择质粒上有的，目的基因上没有的，酶切位点旁边最好带上酶切位点保护碱基，防止引物上的酶切位点降解缺失。

引物设计的原则如下：

1. 引物长度：引物的最佳长度为24或25个碱基左右。但是如果需要调整Tm值，引物的长度可以控制在21至28个碱基之间。当扩增≥10 kb长片段时，25-35个碱基之间的引物可以提供更好的结果。引物过短，会降低产物的特异性，每增加一个核苷酸，引物特异性可以提高 4 倍。引物过长，会使退火过程不完全，与模板结合不充分，以至引起扩增产物的明显减少。

2. 引物末端： 引物3’端最后一个碱基最好为G或者C；引物 3’端应避免出现发夹结构。

3. 引物G+C：含量 引物的GC含量控制在40%-60%之间。

4. Tm值：引物额外附加序列，即与模板非互配对序列，不应参与引物 Tm 的值计算；正向引物和反向引物的Tm值相差不超过5℃为佳，Tm值调整至55℃ -65℃为佳。

5. 碱基的分布：引物 A、G、C、T整体分布要尽量均匀，避免使用GC或者AT含量高的区域；避免连续出现4个及以上的相同碱基，或者某两个核苷酸连续重复出现（例如，ACCCC或ATATATAT；引物内部或者两条引物之间避免有5个碱基以上的互补序列；两条引物的 3’端避免有3个碱基以上的互补序列。

6. 序列特异性：引物设计完毕请使用 NCBI BLAST功能检索引物特异性，以避免非特异性扩增产生。注意: PCR的产量通常取决于PCR引物的3’端，引物间形成二聚体会降低扩增效率。

④“snapgene”模拟分子克隆过程，确保酶切位点添加没有问题，以及载体和片段能够连接上，就可以将引物序列送去生物公司合成

【实验阶段】

①以cDNA或者化学合成得到目的片段的方式，对已有目的基因PCR获取片段，跑胶，鉴定长度。

②切胶，把符合目的片段长度的胶切割下来，胶回收，胶回按照试剂盒protocol来就可以。

③双酶切，按照你设计的酶切位点选择内切酶。配两个体系，基因片段和质粒各一个体系进行双酶切

④跑胶鉴定，载体切开了，跑胶的速度就不一样， 记住，一定要同时跑一个没有经过酶切的载体，这样才方便判断有没有切开。

⑤片段和载体胶回并测定浓度。

⑥配置DNA连接体系，将片段和载体加入。片段和载体的量不是固定的，根据浓度做调整就好。

⑦第二天早上转化，取或连接产物，冰上融化感受态。将连接产物转移到菌中，混匀，放冰上30min（时间可以适当减少到10-15min）热激：42℃，90s（严格步骤），放冰上2min，加入800ul LB培养液，37℃半小时（水浴或者摇床）。此时把培养平板拿出放入培养箱预热。

取出培养液，离心：5000g，3-5min。吸去上清，留约50-60ul培养液，涂板。放到37℃培养箱中培养。

⑧第三天早上挑取单克隆，摇菌

⑨做菌液PCR：模板用菌液，引物用目的基因片段的引物，目的是初步鉴定是否构建成功。这一步也可以采用之前选的两个酶进行双酶切鉴定，如果构建成功，酶切之后跑胶得到的条带是载体+片段。（也可以扩大培养摇菌后提取质粒，对质粒进行PCR鉴定）

⑩挑取跑胶阳性的的菌液，送生物公司测序。