2023年11月17日，Cell在线发表福建农林大学徐通达团队和杨贞标团队题为 “ABLs and TMKs are co-receptors for extracellular auxin” 的研究文章，该研究结合分子生物学和磷酸化蛋白组技术手段，解决了一个跨越了百年的争论，ABP1参与生长素的信号传导，但是其缺失如变体缺少明显表型变化，报道了两个新的生长素结合蛋白ABL1（ABP1-like protein 1）和ABL2，以生长素依赖的方式直接与TMKs的细胞外结构域相互作用，在细胞膜上协同形成ABP1/ABLs-TMK生长素共受体感受并传递胞外生长素信号，调控植物生长和发育的分子机制。同时提出功能冗余不仅仅基于蛋白质序列相似性，还基于蛋白质结构相似性，为植物基因补偿提供了值得注意的见解。
研究背景
⚫ 生长素几乎调节植物生长、发育和对环境的反应的各个方面，并已被证明可以控制发生在几秒钟内与转录无关的快速反应以及较慢的转录反应。大多数快速生长素反应明显受到一类生长素受体的调节，这些受体与核TIR1/AFB受体不同，可能定位于细胞表面。
⚫ 跨膜激酶(TMK)家族受体样激酶是定位于质膜上的许多生长素反应所必需的信号传导成分，包括细胞壁酸化、ROP GTPase激活和蛋白磷酸化等快速反应。生长素激活TMK磷酸化，激活的TMK结构域可直接磷酸化IAA32/34、AHA、MKK4/5MPK3/6、TAA1、ABI1/2等一系列效应物来调控多种发育过程。然而激活TMK依赖性生长素反应的生长素信号感知的分子机制仍然是谜。
⚫ ABP1以生长素依赖的方式与TMK1细胞外结构域形成复合物，表明它可能感知生长素激活TMK依赖的生长素反应。然而由于在拟南芥中敲除单拷贝基因并没有产生可见的表型，因此ABP1在生长素感知/信号传导中的作用一直存在争议。最近的一项研究表明，在拟南芥中，双缺失和突变体在生长素诱导的快速全局磷酸化反应和通道方面表现出类似的缺陷，并且这些生长素反应需要与ABP1结合，这证实了ABP1在TMK1依赖性生长素感知/信号传导中的作用。然而这项研究未能解释为什么许多依赖TMK的发育过程和生长素反应在缺失突变体中不受影响。重要的是，典型TMK是否以及如何感知细胞外生长素仍未得到解决。
⚫ 鉴于敲除突变体缺乏明显的表型，且ABP1主要定位于内质网(ER) ，因此推测可能存在其他细胞外ABPs与TMKs一起作用，感知细胞外生长素。
研究结果
1.ABP1-5表型分析：可能是通过对其他ABPs造成明显的负面影响，最终导致一系列的生长和发育表型受到损害
为了评估是否存在与TMKs作用的其他ABPs，首先对ABP1-5（ABP1-5携带H94Y突变，该突变破坏生长素结合和生长素诱导的与TMK1的相互作用）的影响进行研究，体内表达ABP1-5预计会对与TMKs相互作用的其他ABPs产生主要的负面影响。
将引入突变体中，并分析了与的表型。表现出一系列生长和发育表型受到损害，这在和野生型中均未观察到。研究结果表明，ABP1-5蛋白的积累影响了TMK调节的生长素反应，可能是通过对其他ABPs造成明显的负面影响，而这些ABPs在功能上弥补了ABP1的缺失。
图1.ABP1-5表型分析
2.ABP1同源基因筛选及其定位分析：ABL1和ABL2与ABP1同源性低，且定位于细胞表面，可以直接与TMK1的细胞外结构域相互作用
由于未能通过氨基酸序列同源性在拟南芥基因组中找到明确的ABP1同源基因，因此通过免疫沉淀探索了在TMK介导的生长素信号传导中补偿ABP1的潜在ABPs。免疫沉淀含有ABP1所属的GLP家族成员，将其命名为ABL1。ABL1及其同源ABL2氨基酸序列相似性较高，与ABP1的序列相似性较低，但包含一个保守的金属离子结合结构域，其不变的氨基酸残基被预测参与生长素结合。基于Alphafold的ABL1和ABL2结构模拟预测了与ABP1高度相似的三维结构。基于结构的ABL1和ABL2蛋白的盲对接预测了与ABP1一样保守的生长素结合结构域，这表明ABL1和ABL2可能作为新的ABPs发挥作用。
利用免疫荧光染色和免疫金标记分析拟南芥中ABL1的亚细胞定位，两项实验都显示ABL1几乎完全定位于细胞表面（图2A-B），ABL1在外质体的定位为在细胞表面与TMKs形成复合物提供了空间可能性。免疫共沉淀(CoIP)实验表明，ABL1和ABL2在植物细胞中分别与TMK1形成蛋白复合物，生长素以浓度依赖性的方式增强了TMK1与ABL1/2的相互作用，1-萘基乙酸处理在1 min内诱导了相互作用，表明生长素在植物细胞中快速促进了ABL1/2-TMK1的相互作用（图2C-F）。
接下来使用荧光共振能量转移(FRET)分析来评估ABL1和TMK1是否直接相互作用并通过TMK1的细胞外结构域相互作用。将ABL1-GFP与mCherry-TMK1-ex (TMK1胞外结构域)或mCherry-TMK1 (K616E)(全长但缺少激酶活性)在烟草叶片中瞬时共表达。该分析表明ABL1-GFP与mCherry-TMK1-ex或mCherry-TMK1 (K616E)之间存在直接相互作用，且100 nM NAA处理强烈促进了这种相互作用(图2G-H)。当ABL1保守的金属结合位点的两个组氨酸残基(H100和H102)突变为Ala (A) (ABL1- M2)时，这种生长素诱导的相互作用被完全消除(图2G-H)。综上所述，ABL1直接与TMK1的细胞外结构域相互作用，这种相互作用由生长素促进但不依赖于TMK1的激酶活性。
图2.ABL1定位及于TMK互作研究
3.ABL功能分析：ABL1和ABL2功能冗余，且与ABP1表现出重叠和不同的功能，是生长素在调节蛋白磷酸化中的快速反应所必需的
既然ABL和ABP1都以生长素依赖的方式与TMK1形成复合物，那么ABL和ABP1在功能上是冗余的还是不同的？
通过T-DNA插入或CRISPR-based 的方法获得了拟南芥col0背景中的abl1-1 (abl1)和abl2-1 (abl2)单突变体，但均未表现出明显的生长发育缺陷（图3A）。然而，双突变体表现出明显的形态缺陷，包括幼苗尺寸减小、叶片卷曲、pc形状改变（图3A-D），表明ABL1和ABL2之间存在功能冗余。
为了评估ABP1是否与ABL1和/或ABL2在功能上冗余，构建了双突变体以及三重突变体。突变体没有表现出明显的表型，而双突变体对幼苗生长有轻微的抑制，比双突变体弱得多(图3A和3B)。三重突变体表现出植株尺寸大大减小和叶片卷曲，比双突变体更严重的生长和发育缺陷(图3A和3B)。同时利用不同的恢复实验证明冗余的ABL1和ABL2在功能上与ABP1重叠，但也具有与ABP1无关的生理功能。ABP1和ABL1/2对生长发育的差异作用(图3A - 3D)与其亚细胞分布、空间表达模式以及与TMK1和TMK4共表达的差异是一致的。
图3.ABL1/2与ABP1功能分析
磷酸化蛋白质组学分析显示，在突变体中，生长素诱导的1分钟(89.9%)和5分钟(82%)内的快速全局蛋白磷酸化被消除了（图4），表明ABP1和ABL1/2是生长素在调节蛋白磷酸化中的快速反应所必需的。这些结果证实了先前报道的ABP1在生长素应答中的作用，并进一步支持其与ABL1和ABL2在植物发育和生长素信号传导中的重叠功能。
图4.磷酸化程度分析
4.ABL1/ABP1和TMK1作用机制：协同作用作为细胞外生长素的共受体
既然生长素依赖性TMKs和ABL1/2之间存在物理和功能相互作用，那么是否ABLs和TMKs在细胞表面形成生长素受体复合物？
①使用微尺度热泳法(MST)对生长素与FLAG标记的ABP1和ABL1融合蛋白进行结合分析。ABP1蛋白与IAA的结合KD为4.71 uM，而ABP1-5蛋白几乎很少与IAA的结合(图5A-C)。ABL1蛋白与IAA结合的KD为1.73 uM，而在生长素结合基序中含有突变的ABL1- M2突变蛋白未与IAA结合(图5A-C)。结合回补实验（图5D）表明生长素与abp1和ABL1的结合对其生理功能至关重要。此外，与ABP1一样，ABL1与IBA和PEOIAA结合较弱，与BA、L-Trp、IPA和PIC完全不结合，与2-NAA（一种无活性的NAA类似物）几乎没有结合。
ABL1与NAA的结合亲和力（KD, 365 nM）比先前报道的ABP1与IAA的结合更强(图5A)。正如预期的那样，ABP1-5和ABL1- M2与NAA的结合显著减少，表明ABL1/ABP1与生长素之间的直接相互作用。
②为了进一步证实ABL1和ABP1直接结合生长素，使用哺乳动物细胞表达蛋白进行MST检测。研究结果表明，与ABP1一样，ABL1可以结合活性生长素，而不是非活性的类似物。考虑到TMK与ABLs/ABP1之间的生长素依赖性相互作用，推测TMK蛋白的胞外结构域也可能参与生长素感知，实验结果也表明TMK1的细胞外结构域也直接结合生长素。
基于它们结合生长素的能力以及以生长素依赖的方式相互作用，作者提出TMK1和ABLs/ABP1作为外质体生长素的共受体，而结果表明TMK1-ex与ABP1或ABL1的混合物显示出比ABP1/ABL1或TMK1-ex本身更高的IAA结合亲和力，KD分别为94或525 nM(图6A-6C)。证实了TMK1和ABP1/ABL1共受体之间的协同结合生长素。
图5.ABP1/ABL1和TMK1与生长素作用方式分析
迈维小结
⚫ 发现ABL1和ABL2两种非原质体生长素受体，解决了长达一个世纪的难题，它们属于古老的ABPs家族，专门定位于外质体，调节广泛的细胞质生长素反应，在拟南芥中与ABP1功能重叠，但与ABP1不同。这些蛋白结合生长素的亲和力与ABP1相似，它们的生长素结合活性是其调节生长素反应和植物发育的生物学功能所必需的。
⚫ ABL1和ABL2属于GLP超家族。虽然ABP1也是这个超家族的成员，但除了一个保守的金属结合基序参与生长素结合外，它与ABL1和ABL2几乎没有序列相似性。然而，许多GLP成员与ABL1和ABL2的关系比ABP1密切得多，并且在植物中非常保守，这表明至少一些GLP可能与ABL1和ABL2在功能上是冗余的。因此需要进一步的研究来鉴定与TMKs相互作用并作为细胞外生长素共受体的其他ABL。
⚫ TMK1以生长素依赖的方式与外质体定位的ABP1和ABLs协同相互作用。生长素感知后，激活的TMK结构域直接磷酸化一系列调控许多发育过程的效应物。这种协同结合表明，生长素与ABL1/ABP1和TMK1的结合可能改变其中一个或两个的表面结构，促进它们之间的紧密相互作用。生长素如何改变表面结构仍有待结构研究的解决。
写在最后
磷酸化在控制植物发育过程发挥重要作用，同时也有广泛的研究，拟南芥中约41%的表达蛋白在不同条件下被磷酸化。它们的磷酸化状态主要受蛋白激酶和磷酸酶上的丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）残基调控。蛋白质磷酸化决定了蛋白质的特性，在植物内部激素信号或外部环境信号触发的多种信号通路中是必不可少的。除了本篇徐通达老师的研究文献以外，我们之前也分享过徐通达老师关于蛋白磷酸化过程在植物各类生物过程中的综述解读，也包括植物激素中的蛋白磷酸化（Cell Reports | 超高效！拿捏“性价比”，破解磷酸化密码，开辟作物性状改良新路径）。点击链接，即可跳转查阅~
产品介绍
蛋白质磷酸化是指由蛋白激酶（protein kinase, PK）催化把ATP或GTP γ位磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白磷酸酶（protein phosphatase, PPase）催化，称为蛋白质去磷酸化。作为一种基础修饰类型，蛋白质的磷酸化和去磷酸化几乎参与所有的生命活动，如基因转录、表达、细胞增殖、分化、凋亡、信号转导、免疫调控、肿瘤发生等。
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