前言 在质谱生物样品分析中，内标在确保报告浓度的准确性方面起着至关重要的作用。那么如何找到合适的内标？内标在样品前处理过程、色谱分离和质谱检测过程中如何纠正分析物的损失和实验变化?内标的浓度如何确定?在进行生物样品分析时内标是否有接受标准?内标响应变化的主要原因是什么?它们如何影响定量?为什么首选稳定同位素内标?上述问题都会在下面的文章中进行阐述。 本文重点讲解使用液质对生物样品中的小分子化合物进行定量。 为什么生物样品分析需要用内标法？ 生物样本(血浆、血清、血液和尿液)是非常复杂的。它们含有多种基质成分，如蛋白质、脂类和盐。为了能用液质准确定量这些基质中的待测物，通常需进行适当的前处理（稀释、提取、浓缩和复溶），这些样品处理步骤中，分析物可能会有一定的损失。此外，在质谱进样过程中，离子的抑制或增强、进样体积的改变也会导致待测物响应发生变化。 那为什么需要使用内标法就不言而喻了：
补偿制备和样品提取过程中的样品间的差异性
不同次进样之间的实际进样量与实际待测物响应的差异性（质谱分析，一般使用待测物与其内标信号比(而不是使用分析物的绝对信号)进行定量）
因基质效应引起的仪器性能或响应变化的补偿
因此，内标越与分析物具有相同或相似的物理和化学性质，它就越有助于跟踪分析物的响应。才能纠正样品处理过程中的损失和质谱进样过程中响应的变化，从而提高未知样品的最终分析结果的精度和准确性。 如何找到合适的内标？ 液质生物样品分析分为三个阶段，既样品提取、色谱分离、质谱检测，内标选择需要考虑在这三个阶段均能有效的跟踪待测物。 1. 内标的类型
同位素内标
常见的有D、13C、15N、17O（在一些化合物中，氘化内标比其它标记的内标不稳定，且回收率也有可能存在显著差异）
结构类似物
具有不同的质量甚至相同的质量（后一种情况下，若MRM离子对无法区分，则必须基线分离） 内标的关键结构和功能(如COOH、SO2、NH2、卤素和杂原子)最好与被分析物相同，仅有碳氢基团(长度和/或位置)不同。功能基团上的改变将导致电离效率和萃取回收率的差异。 结构类似物，一般都有相同的治疗效果，例如下面这4个化合物，都属于鸟嘌呤类似的抗病毒药物，即含有鸟嘌呤的关键部分。
如何进一步确定哪一个结构类似物更适合做内标？大家可使用软件（例如，Pallas）对比它们的物理化学性质，如logD(疏水性)与 pH值。
如上图所示，acyclovir 和 ganciclovir适合做penciclovir的内标，尤其是后者，因为含有相同数量的羟基，但valacyclovir就显然不适合，因为引入了额外的胺部分，并且没有羟基部分。 2. 内标应满足的条件
与待测物具有相同或非常相似的物理化学性质,尤其是疏水性和电离特性。它可以紧密模拟的分析物在每一个阶段的变化,也就是说,从样品制备、色谱分离、质谱检测。这样，样品制备过程中的任何损失或质谱检测中的变化都可以被纠正。
内标必须具有足够的纯度。内标对待测物的干扰，小于待测物峰面积的20%。
在样品处理和液相分离过程中内标稳定。不能被明显降解，特别是不能分解成干扰分析物测定的组分。
不应该为待测物的任何体内代谢产物。如，葡萄糖醛酸结合物、N-氧化代谢产物。
内标的浓度如何确定? 一般认为，只要在一个批次(运行)的所有样品中，即校准标准品、质量控制和未知样品中加入等量的内标，内标的浓度并不重要。这可能就是为什么没有多少关于如何确定内标的适当浓度的信息存在的原因。内标浓度如何确认，应考虑以下所有因素。 1、标准品纯度及目标校准范围 内标标准品中，分析物的峰面积小于分析物LLOQ峰面积的20%，甚至更小。分析物标准品中，内标的峰面积小于正常内标峰面积的5%，甚至更小。换句话说，分析物和标准品的纯度决定了最大可能的浓度范围。 2、质谱对分析物及内标的灵敏度 当质谱对内标物的灵敏度高于分析物时，可以使用相对较低的内标浓度。否则，需要更高的内标浓度。另外，不应让内标与待测物的响应差异过大，这样可能会得到不可靠的线性回归结果（线性回归使用的是分析物峰面积与内标的峰面积比值，可以想象当内标足够大时，不同浓度标曲样品的比值可能就无限接近了） 3、离子抑制或增强 当存在基质效应时，最好使用同位素内标，以更好地减少基质效应对定量的影响。它们的色谱峰重叠程度越大，校正效果越好。 由于被分析物的浓度是变化的，而添加的内标是恒定的，所以必须做出选择，以匹配校准曲线的哪一部分。通常，ULOQ的1/3到1/2之间的部分是最重要的，因为这个部分预计涵盖大多数药物和代谢物的平均C max。这可能就是为什么其他研究人员建议使用浓度约为分析物ULOQ的1/3或1/2的内标。 当分析物与同位素内标响应足够高时，质谱响应饱和，抑制分析物与内标的响应时，另一方面，当内标被分析物抑制时，为了获得良好的重现性，高IS浓度是必要的。 4、SPE萃取盒的溶解度和装载能力 IS浓度不应过高，以免引起溶解度问题或超过固相萃取(SPE)墨盒或类似产品的负载能力。 为什么要监控内标响应的变化？ 1. 使用内标的目的，是校正整个分析过程中（样品提取、色谱分离、质谱检测）的变化（不然为什么要加内标了？），比较未知生物样品与标准样品还是有很大的区别的，例如，代谢物、基质批数和冻融循环的差异等。
2. 一个分析批次中内标响应变化太大可能会引起对所获得定量结果准确性的怀疑，因为所有样品中都添加了相同量的内标。 如何监控以及评价内标响应的变化？ 法规上对“内标异常”是没有具体要求的，因此实验室中需要有自己的标准。大多数实验室，是将样品的IS响应与同一运行中已接受的校准标准品和质量控制的平均IS响应进行比较，即符合准确度接受标准且未显示其他异常（例如，色谱不良）。当样品的IS响应超出校准标准品和质量控制品平均IS信号的50％时，则认为内标异常，需要对这个样品进行复测。 内标响应异常的典型原因有哪些? 1、内标加入时的错误（多加或未加） 内标添加到样品中的量的任何变化或误差都直接影响IS响应，标准样品内标加入错误是很容发现的，因为他们的浓度是已知的，然而对于未知样品，则很难确认是加入错误还是仪器响应波动带来的误差，除非内标响应接近于0或者是其它内标的2倍。
2、自动进样器故障 在进样过程中，自动进样器的针必须穿过瓶盖吸取装入样品。碎片可能会完全或部分地阻塞自动进样器的针，这将导致样品进样的不准确。这种情况下内标变化没有明显的规律，一般受到影响的样品内标响应都会降低，但定量的准确性一般没有问题，除非没有或非常少的样品注入，导致响应超出线性范围或达不到信噪比（S/N）。
3、基质样品间的差异 例如，在一项研究中观察到受试者所有样本(包括剂量前样本)的IS响应较高(高于标准样本)(图12a)。柱后(洗脱后)输注试验表明，用于制备标准样品的混合对照人体血浆中存在离子抑制(图12b)。然而，对于具有高IS反应的受试者的剂量前样本，这种离子抑制是不存在的(图12c)。
再例如，在一项研究中内标响应波动是因为生物样品比标准样品的LLE中有机层和水层之间的中间层要厚，导致生物样品在吸取过程中中间层有少量转移，从而导致了MS检测过程中的离子抑制。
内标响应变化对定量的影响 解决IS响应变化的主要目的是确保尽管观察到IS响应有变化或异常，使未知样品的定量分析不会受到影响。不幸的是，在大多数情况下，对这个问题没有明确的是或否的答案。最好的方法是通过使用一些预先约定的评判标准，例如在同一运行中接受的标准样品的平均IS响应的50％以内，来监测生成的样品分析过程中IS响应的变化。一旦观察到可变或异常的IS反应，应在存在模式或趋势的情况下评估或调查每种情况。根据评估或调查的结果，重新进样分析受影响的样品。 总结 查看内标的响应波动是每个分析批次的都需要做的事情，这是确保分析批次接受和未知样品结果可接受的几个步骤之一。生物分析方法验证指南和法规也强调了此要求。因此，需要在实验中正确识别内标响应异常的原因，是偶然现象还是普遍现象，不能过分夸大，所有出现的问题既有文件记录的流程又要有合理而理性的思考，这是处理内标异常系统可变性的关键。
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