在设计引物之前，先记住几个参数

1.引物长度：通常在18-30bp之间，推荐长度为20bp左右，不超过25bp。

2. GC含量：30%-80%，最佳范围是40%-60%。

3. 引物Tm值：最好在60℃左右，上下游两条引物Tm差异不要超过5℃。

4. 扩增产物大小：80-300bp，推荐长度为150bp。

5.引物自身不能有连续 4 个碱基的互补，避免形成发卡结构。引物之间不能有连续 4 个碱基的互补，避免形成引物二聚体。

01 引物设计

1、设计引物时，首先访问NCBI（National Center for Biotechnology Information）。在搜索框内输入需要设计引物的基因名称或ID，以human的“BCL2”基因为例。输入相关信息后，点击“搜索”，进行搜索。

网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/      

2、在搜索框内输入需要设计引物的基因名称或ID，以human的“BCL2”基因为例。在搜索框内输入好信息后，点击“Search”，进行搜索。                                                                                     

3、点击“Search”后，出现以下页面，页面上会显示常见物种的”BCL2”基因，我们是以“human”为例。下图2个红框，任意点击“BCL2”，既可以进行基因详情页。

4、进入详情页后，核对一下基因名称和物种信息。此页面下拉至“NCBI Reference Sequences (RefSeq)”

5、在“NCBI Reference Sequences (RefSeq)”找到“mRNA and Protein(s)”，就可以找到基因序列信息，也可以看到基因有几个转录本信息。我们可以任意选择一个转录本，点击进去。

6、我这里点击“NM_000633.3”，会进入基因序列信息详情页，如图1，下拉页面，找到“CDS”字样点击后，会跳转至CDS区域的基因序列信息。CDS是编码区域，一般设计引物，尽量选择CDS区域。

7、找到CDS区域后，即可进行引物设计了，首先复制CDS区域的基因序列，然后上拉页面至顶端点击右侧“Pick Primers”

8、进入引物设计详情页面，将上步复制的“CDS”区域的基因序列，复制进入“PCR Template”中，一般需要修改的数据，见下红框标注。其余可以默认。设置好后，下拉点击“Get Primers”，开始进行引物设计。

9、点击之后，会出现以下页面，直接选择“Submit”

10、“Submit”后，最终出现多对引物序列，根据前言部分的内容，选择合适的引物对。

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02 引物比对

最后，也是最关键的步骤，选择好合适的引物对，需要进行“引物比对”，来看引物的特异性情况，要保证所选择的“引物对”扩增不来其他的基因。

1、进行NCBI首页。在右侧找到“BLAST”。

2、进入“BLAST”详情页后，选择“Primer-BLAST”。

3、进入“Primer-BLAST”详情页后，将选择合适的“引物对”输入，此时需要注意的是“Organism”部分的信息。物种信息一般默认是“human”，如果是其他物种的，记得修改成对应物种。最后点击“Get Primers”。

4、出现比对结果，确保所选择的“引物对”扩展不出来其他基因即可。

至此，才是引物设计的才全部完成。

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