1. 过表达载体的应用
应用实例1
图1
构建TFAP2C的过表达载体，构建成功后，转染到细胞后进行验证，qPCR从mRNA水平上验证TFAP2C的表达，WB从蛋白水平上验证TFAP2C的表达；
图2
上图检测构建载体成功后，转染到细胞开展细胞表型实验：平板克隆形成实验，来验证Aniotinib处理和TFAP2C过表达对细胞增殖的影响；
引用文献：Fang Fuxiao,Yuan Qing,Anlotinib inhibits the proliferation, migration and invasion, and induces apoptosis of breast cancer cells by downregulating TFAP2C.[J] .Oncol Lett, 2022, 23: 46.
应用实例2
图3
通过pcDNA3.1质粒来构建LMP-1过表达载体，并通过qPCR和WB进行结果验证；
图4
上图检测构建载体成功后，转染到细胞开展细胞表型实验：流式检测细胞的调亡，来验证IL-1β处理和LMP-1过表达，以及二者共处理对细胞调亡的影响；
引用文献：Li J, Liu H, Dong S, Zhang Y, Li X, Wang J. ALKBH5 Is Lowly Expressed in Esophageal Squamous Cell Carcinoma and Inhibits the Malignant Proliferation and Invasion of Tumor Cells. Comput Math Methods Med. 2021;2021:1001446. Published 2021 Nov 28. doi:10.1155/2021/1001446.
实际应用：通过构建目的基因的过表达载体，从而调控基因或蛋白的表达，再通过细胞表型实验（包括CCK8，划痕实验，细胞迁移，细胞流式等）验证目的基因所参与的生物学功能；或者通过检测上下游信号分子的激活或抑制，如pERK，pAKT，NF-κB，MAPK/JNK等，验证目的基因所参与的信号通路。
2. 过表达载体构建的步骤
2.1 目的基因CDS区碱基序列的获取及引物设计
图5
具体事例：构建A基因的过表达载体所需要设计的引物
Ø A基因的CDS区序列（NCBI上下载）：ATGGCCCGCGCTGCTCTCTCCGCCGCCCCCAGCAATCCCCGGCTCCTGCGAGTGGCACTGCTGCTCCTGCTCCTGGTAGCCGCTGGCCGGCGCGCAGCAGGAGCGTCCGTGGCCACTGAACTGCGCTGCCAGTGCTTGCAGACCCTGCAGGGAATTCACCCCAAGAACATCCAAAGTGTGAACGTGAAGTCCCCCGGACCCCACTGCGCCCAAACCGAAGTCATAGCCACACTCAAGAATGGGCGGAAAGCTTGCCTCAATCCTGCATCCCCCATAGTTAAGAAAATCATCGAAAAGATGCTGAACAGTGACAAATCCAACTGA
Ø pcDNA3.1过表达载体的序列-实验室已经测序过的序列： 实验室保存下来的质粒序列，使用之前送生工测完整序列；
Ø 寻找合适的酶切位点
目的基因 ---- 找序列上没有的酶切位点；
载体 --- 找序列上没有的酶切位点+载体上唯一的酶切位点
Ø 选择的酶切位点
KpnI和XbaI，酶切位点如下
KpnI 酶切位点
XbaI 酶切位点
Ø 构建过表达载体的引物设计
引物由“保护碱基+酶切位点+引物序列”组成；
保护碱基（网上百度可查每个酶切位点的保护碱基）；
KpnI 保护碱基
XbaI 保护碱基
Ø 加入保护碱基和酶切位点的目的基因序列（绿色为保护碱基，紫色为酶切位点）
GGGGTACCCCATGGCCCGCGCTGCTCTCTCCGCCGCCCCCAGCAATCCCCGGCTCCTGCGAGTGGCACTGCTGCTCCTGCTCCTGGTAGCCGCTGGCCGGCGCGCAGCAGGAGCGTCCGTGGCCACTGAACTGCGCTGCCAGTGCTTGCAGACCCTGCAGGGAATTCACCCCAAGAACATCCAAAGTGTGAACGTGAAGTCCCCCGGACCCCACTGCGCCCAAACCGAAGTCATAGCCACACTCAAGAATGGGCGGAAAGCTTGCCTCAATCCTGCATCCCCCATAGTTAAGAAAATCATCGAAAAGATGCTGAACAGTGACAAATCCAACTGAGCTCTAGAGC
2.2 PCR扩增目的基因
PCR扩增体系
2.3 质粒纯化
Ø 接菌：菌种活化，涂板，挑单克隆，摇菌；
LB平板
Ø 提质粒：市面上有成熟的提质粒试剂盒；
质粒提取试剂盒
2.4 限制性酶切
酶切体系
2.5 酶切产物纯化：市面上有成熟的DNA纯化试剂盒；
纯化试剂盒
2.6 连接
连接体系
2.7 转化：热激法转化
Ø 清洁工作台并保证所有的设备都已灭菌；准备无菌的液体培养基和含有抗生素的LB平板；
Ø 预热培养液和含抗生素的LB琼脂板到37度，并且将水浴锅调至42度；
Ø 冰上融化感受态细胞，加1-5 ul 1ng/mL预冷的连接产物溶液到感受态细胞中，轻轻混匀；
Ø 感受态细胞和质粒的混合物在冰上放置30min；
Ø 30min后，将感受态细胞和质粒的混合物置于42度水浴中热激30秒；
Ø 将混合物从42度水浴中取出，立即置于冰上，并加入450ul LB液体培养基；
Ø 置于37度摇床上，225rpm震荡培养1h，使细胞得到恢复；
Ø 1h后，吸取20到200微升菌液加到LB琼脂板上，均匀涂布到平板上；
Ø 37度温度培养箱，倒置培养过夜；
Ø 第二天，观察菌落数，挑取菌落做进一步的实验；
2.8 筛菌：菌落PCR，我们实验室一般用牙签挑菌，主打一个快准狠；
2.9 测序及比对：送生工测序，snapgene软件进行比对；
