为什么Western Blot目的条带跑出了两条带？

李QQQbili

2023年05月26日 21:17

来自一个懒人总结的老师讲解内容，我觉得这样方便快速查找解决问题方法

WESTERN BLOT问题及解决方案

（哔站“六月风”老师）

如何快速锁定WESTERN BLOT实验出问题的原因

第一：充分了解WB的每个实验环节的原理，比如样品制备，为什么要把样品放在冰上？

第二：学会界定是实验方法问题还是实验操作问题，比如转200kd大分子量蛋白，如果半干转来做没有信号，不管操作有没有问题大概率是实验方法问题，如果是湿转法没有信号，就要考虑实验操作有没有问题

第三：学会用反推、排除、对比、拆解来快速锁定问题出现在哪个实验环节

反推就是根据结果的现象一步步向上反推找到这个实验现象的最终原因，例如条带上有个白点→白点说明蛋白没有从胶上转到膜上→胶和膜之间没有形成电场→胶和膜中间没有完全贴合→可能有气泡

对比：不同时间、不同实验、不同蛋白、不同人操作进行对比来找到实验出问题的原因。一般对比方式有跟自己过去的实验做对比，跟其他实验做对比，跟别人的实验做对比，不同蛋白之间做对比，以此通过实验间的差异因素可以快速锁定实验问题原因

排除：列出来导致实验结果的所有原因，逐条排除掉。例如wb结果没有条带→①曝光时间太短②本身没信号③背景信号太高④抗体失效⑤转印不成功→逐条排除

拆解：把大问题拆解到实验的每一个环节里面进行原因的查找和问题的锁定。例如小分子蛋白做不好→电泳环节：胶的选择、电泳条件；转膜环节：干转还是湿转、转膜缓冲液的选择、是否加sds、甲醇

四：有些问题是可以直接忽略的。例如内参跑出两条带→找到两条带原因→解决内参实验问题→解决wb实验问题（最终目的）。两条带出现的原因可以先搁置，先把wb实验做好，因为实验室内参都一样，让别人帮忙做一次内参，直接解决实验问题。

A样品制备方面

一、WHY目的条带是两条带

首先排除非特异性条带（抗体很难保证只和目的蛋白结合）

原因一：蛋白修饰，磷酸化，糖基化等，如果修饰的只是你目的蛋白的一部分，就会出现两条带，其中一条带会比你的目的蛋白分子量大一点

原因二：蛋白降解，降解部分比原来分子量小，但仍包含抗原位点

原因三：蛋白多聚体

还原剂正常工作，同源二聚体做出来是一个条带，出现两条带可能是实验控制不太好，还原剂可以把链间二硫键打开，把二聚体变成单体，如果还原剂出问题有些二聚体没打开，另一条在高分子量区

异源二聚体如果都能被抗体识别，结果是两条带，趋势一样

原因四:剪切变异体

一个基因通过选择性剪切产生不同分子量大小的蛋白，但都包括你选择的抗原位点，所以有几个剪切变异体就有几个条带

B电泳相关

一、条带中间缺一块

原因一：样品盐浓度过高导致样品沉淀，样品没能跑下来

原因二：浓缩胶没有完全聚合时拔梳子或粗暴拔输，导致上样孔底部凸起，样品集中在两侧（浓缩胶彻底聚合，轻拔梳子）

原因三：转印时条带位置膜与胶之间有气泡

二、条带连在一起了

1.样品制备：盐浓度过高

解决方案：脱盐柱脱盐/低压跑盐

2.保存不当，浓缩胶和分离胶离缝，样品跑到离缝处样品融合导致

3.保存胶过程中，冰箱内部背部侧面结冰，放在这种位置凝胶冻融，凝胶与玻璃板离缝

解决方案：电泳缓冲液加自封袋保存，不要放在冰箱壁位置

4.上样体积过大，样品溢出，

5.样品蛋白浓度过高，跑的时候蛋白被压着往两边扩散

6.抗体浓度过高，发光信号特别强会溢出

7.化学发光成像是信号累加的，动态过程曝光时间过长，信号变强，信号会串在一起（减少曝光时间）

三、条带宽窄不一致

1、配胶拔梳尺时宽窄不一样

2、孔宽一致时，考虑样品盐浓度不一致，盐浓度越高，蛋白弥散越宽，盐浓度越低，蛋白被压缩，条带窄

解决办法：1提高配胶质量，2，脱盐柱蛋白过柱脱盐3、便宜方法，低电压10—20V跑20min，让低分子量的盐离子跑分离

四、条带呈微笑状或者八字状

（1）微笑（中间跑的快，两边跑的慢）

1.电泳跑的太快，电压太高

2.电泳过程中温度太高

产热大原因：电泳功率太大导致温度高或散热不好

解决方案，推荐冰浴

（2）皱眉（中间跑的慢）

电泳过程中胶两边漏液

胶的两边和玻璃板的垫条之间出现裂缝，有电泳缓冲液从上槽往下槽走，这个位置的缓冲液比较新鲜，离子强度高。胶中间的缓冲液稳定在电泳，离子强度低

漏液原因：干燥（不要放置太久/缓冲液保存）

胶冻融

装玻璃板时用力过大导致位移

玻璃板缺口和垫条没有密封

五、泳道未加样却跑出了条带

原因一：加样体积太大溢出到旁边的孔里

原因二：加样时枪头带样到了旁边的孔里

原因三：浓缩胶和分离胶离缝

原因四：胶和玻璃板之间发生离缝

原因五：电泳缓冲液污染（内槽液每次用新鲜缓冲液，）

角蛋白污染，角蛋白在58、64kb两个位置，如果所有的泳道里58、64kb都有两个条带而且是连在一起的（重新配置缓冲液）

六、条带向上拱起

1.胶里面有气泡

2.胶里面有不溶性颗粒

3.催化剂过量且混合不均匀

C转印相关

一、半干转方法有哪些坑

半干转印分为传统半干转和快速半干转，原理一样（两块金属电极板形成电场进行转运）

本文主要讨论传统半干转

坑1：说明书里推荐的条件不是最优条件

坑2：半干转转小分子量蛋白更容易穿透

坑3：半干转超大分子量蛋白效果不好；（大分子在电场作用下走的慢用时长，半干转能够提供离子的仅仅是滤纸上吸附的转膜缓冲液的离子，离子在电场的作用下从负极滤纸转走了，等负极滤纸上缓冲液没有离子时即无电场因而转不动蛋白）

坑4：延长转膜时间不一定能提高转膜效率，还可能因为电场产热降低目的蛋白产量。

坑5：转膜中途加缓冲液可能会导致位移，会发生拖尾、漂移等现象

坑6：marker和目的蛋白转膜不等效

推荐条件：胶面积（平方厘米）x2恒流，转40分钟到一个小时

小分子量蛋白还需优化

大分子量蛋白：阴极缓冲液加SDS，阳极缓冲液加20%甲醇

（在推荐条件下，小分子量大概到120kd左右的蛋白转膜效率相对较好。如果小于20kd小于15kd，还需优化条件）

二、膜上有白点

原因一：转膜时胶和膜之间有气泡。气泡不在目的和内参条带上，对结果无影响。

解决方案：赶净气泡

原因二： PVDF膜未被甲醇完全活化，没活化的地方无法结合蛋白，最终成像为不规则白点

原因三：膜质量有问题

D封闭相关

一、条带结果有黑色斑点

原因一：用脱脂奶粉做封闭液，如果没有完全溶解，封闭液里会有小颗粒会沉淀到膜上

如果不确定有没有完全溶解，可以过滤后使用

原因二：膜污染，例如膜掉落到地上

PS:一般都是脱脂奶粉没溶解好。除了老师说的过滤，你可以

1.增加溶解时间，如果你是在孵育盒里溶解的话，你可以电转开始后就去把奶粉溶解上。

2.加大力度，先在离心管里配好用手摇，然后再倒到孵育盒里。

3.封闭时蛋白那面的膜朝下

4.换厂家，比如贵的BD的。其它可食用的脱脂奶粉，也没问题。德运的、雀巢的。

5.封闭后可以多洗一次，5min×1换成5min×2适当延长时间也可以

6.封闭后洗完换孵育盒，再加一抗

第三条稍微有点玄学的意思

E抗体相关问题

一、条带反白或者空心化

反白原因：抗体浓度太高（二抗标记了辣根过氧化物酶，酶与底物结合最后有发光信号。抗体浓度高，底物被迅速消化掉，无法发光所以反白）

空心化原因：条带中心抗原浓度太高

解决方法

1.降低抗体浓度（先降一抗或同时降）

2.降低蛋白浓度，可以同时降低抗体浓度

3.膜已做好，发光液加上就拍照（不一定有用，只能试一试）

提醒：荧光法使用抗体浓度更高，不能无缝转化学化发光

只有一个条带空心化原因：转印时这个位置有气泡

F综合问题

一、Western Blot蛋白表达与QPCR基因表达结果不一致

两种可能：

1）实验技术没问题：

客观上确实不一致，可能存在翻译后调控或修饰？

2）实验技术有问题：

客观上应该一致，但由于蛋白、RNA单方面验证或者两方面验证失误，导致两个层面表达结果不一致

Part1：Western Blot 蛋白层面

（一）、蛋白样品制备环节失误

取材到液氮速冻耗时过长，蛋白发生降解
取材后，制样时，没有保持低温环境
没加蛋白酶抑制剂，蛋白发生降解

（二）、蛋白发生可逆性沉淀

低温保存时，蛋白浓度高容易导致蛋白沉淀
样品盐浓度过高，通过盐析发生沉淀
蛋白质大多数都在高pH时溶解性高，低pH时易沉淀。（当loading呈现黄色的时候，提示蛋白样品酸度过高，容易产生沉淀，影响电泳结果）

（三）、发光成像环节出错

过度曝光导致定量结果错误，结果不可信
不同成像方法定量范围不一样

常用：冷CCD化学成像（适中）

不常用：暗房压片（弱），电子压片（强）

（四）、结果分析环节

用原始成像结果（有蛋白无marker的图片），不用Merge结果（既有蛋白又有marker的图片）

Part2：QPCR mRNA层面

（一）、总RNA样品提取环节失误

取材到液氮速冻耗时过长，RNA发生降解
取材后，制样时，没有保持低温环境
没有有效防范外源性RNA酶的污染

（二）、引物的问题

引物设计策略有误，没有跨外显子
引物形成二聚体，熔合曲线呈现双峰
引物实际扩增效率未检测，却默认为100%计算

二、结果背景很高？

1PVDF膜活化不充分

2PVDF膜，镊子或转印buffer污染

3封闭不完全（磷酸化蛋白建议用BSA封闭，奶粉中酪蛋白羟基易结合磷酸基团）

4抗体浓度过高

5洗膜时间或次数不足（可提高TBST中吐温浓度或加入SDS

6曝光时间过长

其实有时候换个显影液也有奇效

三、没有信号怎么办

1：就是没信号

2：有信号但实验某个环节出问题了而检测不到（下文主要讨论此原因）

part1.样品制备

1.超声时间太长，探头产热太大导致蛋白降解

2.样品制备没有放在冰上导致蛋白降解

3.没有加蛋白酶抑制剂，导致目的蛋白降解

4.细胞破碎不充分，获取蛋白少

5.蛋白煮了太长时间导致蛋白降解

6.样品放置太久导致蛋白降解

7.样品冷冻导致蛋白沉淀（重新加热溶解样品100度5分钟以内）

part2:电泳

1.小分子蛋白不要跑的太远，剪膜够用就好

2.电泳产热太大，导致条带弥散，信号分散而看不到

3.电泳产热太大，导致蛋白降解

part3：转印

1.pvdf膜没有甲醇活化，不能结合蛋白

2-1转膜太久，样品穿透

2-2转印时间不够，蛋白没有转上去

提醒！marker和目的蛋白转印不完全对等（marker转的好不代表蛋白转到膜上，marker本身简单，泳道里就几种蛋白，目的蛋白里几百上千，互相可能影响

可以烤染下胶或用丽春红染转膜后的膜看一下转膜效率）

3.转膜产热导致蛋白降解

PART4封闭

没封闭好导致抗体结合到膜上，背景高掩盖信号

封闭试剂与抗体交叉反应

PART5抗体

抗体质量、浓度问题，抗体已失效（反复冻融所致）

PART洗膜

洗膜时间过长，次数过多

PART成像

曝光时间不够长，没信号

曝光时间过长，全黑，没信号

PART检测方法不够灵敏

五、上样量很大，结果蛋白却很少

原因：蛋白样品有沉淀

沉淀大于胶的空隙，跑不下去

有沉淀的原因：

1、加热时间不够（变性不充分）

2、SDS浓度不够（稀释过程中有误差）

3、样品蛋白浓度过高（蛋白质聚集形成沉淀）

4、盐浓度过高

PS：

一、小蛋白做WESTERN的注意事项

现象描述：

分子量越大的蛋白条带倾向于被压缩的比较结实，

分子量越小的蛋白条带却呈现向四周弥散的趋势。

大分子量条带，方正，棱角突出（紧实长方形）

小分子量条带，圆润，棱角模糊（弥散椭圆形）

同时还存在加样孔各泳道同一水平的条带长短不一的情况，初步考虑可能加样时未将各孔加样量用1 x loading补齐至同一水平，从而造成各泳道电荷量不同，导致电泳迁移率出现差异，引起高迁移率泳道的蛋白向低迁移率泳道弥散。

分子量越小蛋白，其所能结合到的SDS量也越少，在电场作用下迁移的过程中也会向四周有一定的弥散。

1）结合SDS的一部分，电荷大，迁移率高，跑得快

2）未结SDS的一部分，电荷小，迁移率高，跑得慢

3）跑的慢的，要么被抛在身后，要么被挤在身侧

解决方案：

选择浓度为15%以上的凝胶，或者梯度胶
增加浓缩胶比例，使蛋白样品在分离前充分压缩，使所有蛋白在同一起跑线上
确保目的蛋白和内参充分分离的情况下，缩短电泳距离，减少弥散的可能
电泳过程中注意降温，高温会加快分子运动，导致弥散现象加剧
转印buffer不要加SDS，要加20%甲醇（可将小分子蛋白上的SDS洗脱，有效防止其穿透PVDF膜；同时甲醇可以帮助转到膜上的蛋白固定在膜上，使其不易脱落）
转印膜选择0.22um的PVDF膜，不要0.45um（17kDa以下的蛋白基本都会穿透），当穿透比较严重时，也可两张0.22um膜叠加使用。
减少转膜时间，降低转膜电压电流（恒压90-100V，1h，或者恒流2000-250mA,15-30min）转膜后用考染验证小分子蛋白是否完全转移

经验教训

Western Blot一般简称为WB，中文称为蛋白质印迹法，定性或定量分析蛋白质在细胞或组织中的表达情况，是一种常用于检测抗体蛋白质的方法。

这个方法费时费力，而且器材和试剂选用不当的话，定量精准度不高，误差较大，一般用作定性分析和不需求高精准度的定量分析，要求比较高的都选用别的方法去做抗体检测了，譬如流式细胞术（FCM）……

以我的经验来看，对最终结果影响最大的是两个因素——抗体蛋白质的质量(效价)和显色灵敏度（化学发光ECL灵敏度，胶片显影灵敏度，DAB染色）。

下面从步骤来分析各环节影响以及可能出现的各种问题。

1.蛋白样品制备

蛋白样品一般分两种，组织样品和细胞样品。组织样品来源于医疗机构肿瘤组织切片，实验动物脏器等。组织样品的制备需要先将样本切成小块再用匀浆器混合裂解液进行研磨或者超声波破碎。细胞样品来源于培养或者购买的细胞。细胞样品的制备需要在细胞样本中加入裂解液，再进行超声波破碎。

（1）这一步骤一般不会出现问题，购买的裂解液一般都含有酶抑制剂和别的物质防止提取蛋白的过程中使蛋白变性降解。提取的蛋白样品尽量迅速转移到-20°C保存，细胞样品可以在贴壁细胞脱落后刮下来转入50ml或15ml离心管冰浴再进行后续的超声波破碎或其它操作。

（2）注意研磨和裂解要充分，尽可能充分提取蛋白。

相关资料

·https://www.cellbank.org.cn/index.php（中科院细胞库）

·https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/protein-biology/protein-purification-isolation/cell-lysis-fractionation/cell-lysis-total-protein-extraction.html（ThermoFisher细胞裂解液）

2.制胶

将大小玻璃板对齐后放入夹子夹紧，夹紧后下方垫海绵再卡在架子上。配制分离胶，先加入其他组分，最后再加入APS和TEMED，混匀后灌胶。灌胶时将枪头抵在大玻璃板处打出，使其沿玻璃板流入，快到夹子绿线时放慢速度。用枪抵在大玻璃板上缓慢加入水或乙醇液封静置，当出现一条明显折射线时表示分离胶已经凝固，倒掉液封用的水或乙醇，并用吸水纸吸干净。配制浓缩胶，同样最后加APS和TEMED，混匀后灌胶。将梳子插入浓缩胶静置。凝固后将梳子拔出，清洗玻璃板。大板在外小板在内放入电泳的夹子夹紧。

（1）玻璃板一定要清洗干净，防止有杂胶残留或其它杂质残留，否则造成凝胶变形，有气泡等。

（2）玻璃板下端和左右必须对齐夹紧，否则极可能出现漏胶，则需要重新灌胶。

（3）配制胶的浓度的选择根据待测蛋白分子量大小确定，大分子量蛋白用低浓度，小分子量用高浓度。

（4）配制胶时严格按照所需浓度配方执行，加错导致胶浓度过高或者过低影响实验结果。添加所需的10%SDS低温环境会凝固，可以放在37°C恒温箱保存。SDS添加的量不对会导致条带形状不规则。

（5）APS（过硫酸铵）为催化剂，TEMED（四甲基乙二胺）为加速剂，配胶时先加入可能会导致凝胶过快，无法灌胶。也可以在环境温度较低的时候适量多加APS和TEMED加快凝胶。

（6）灌胶时要沿大玻璃板加入，先快后慢，可减少气泡的出现，也可使成胶更加平整。

（7）液封时加入水或乙醇一定要慢，否则分离胶会被冲变形。

（8）浓缩胶凝固时会收缩，可以适当补胶。

3.电泳

将电泳的夹子对照电泳槽正负极正确放入，在电泳夹子内加入电泳液至少没过小玻璃板，电泳槽内加入电泳液至少没过电泳夹子下方导线。根据记录向孔内加样品。确认无误后打开电泳仪电源开关，设定模式为恒压模式，设定电压和时间。恒压90V跑5min，170V跑55min。蛋白样品中的染色液刚跑出时停止电泳。（电压及时间并非一成不变，可根据凝胶浓度及待测蛋白表达分子量大小做出调整，不同的电泳设备也会使此参数变化，此处仅为参考。）

（1）正负极不可放反，放反会导致蛋白样品向上电泳跑出加样孔。（如有特殊情况，蛋白样品加错时可将正负极反接使蛋白样品跑出加样孔再换掉电泳液，一般不建议）

（2）夹子内的电泳液一定没过小玻璃板，电泳槽内电泳液一定没过夹子下方导线，否则无法形成通路。或者根据电泳仪报错代码判断。

（3）电泳液内的SDS也会使条带不规则，10×电泳液配制时要Tris，Gly完全溶解后再加入SDS，溶解较慢时可放入37°C恒温箱过夜。夹子内的电泳液尽可能现配现用，夹子外，槽内的电泳液可使用夹子内回收的（不建议多次重复使用，最多两次，会含有大量不同种类的蛋白）。

（4）蛋白样品需95°C或100°C加热5-10min使其变性，也可加入DTT将二硫键还原为巯基，都是为了破坏蛋白的高级结构，尽可能只保留一级和二级结构。向加样孔加样时首先要了解所使用的制胶设备所制凝胶加样孔容量，加样量不宜超过容量的80%。加样时要慢，不可突然打出大量样品，会导致样品无法落入加样孔内，还会溢出落入相邻加样孔。（由于设备原因，两侧的加样孔可能会成U型偏斜，可以放弃使用或加Mark及不重要的样品。）

（5）电泳仪模式不可设置错误。（此错误一般不会犯，但是有幸见过一次，在恒流模式下设定参数为恒压时参数，导致电压过低，条带跑不开，条带都集中在一小块区域内。）

（6）蛋白无较小分子量表达时可适当增加电泳时间让小分子量跑出去以获得更高分辨率。（可观察预染蛋白较小分子量在凝胶中的位置来判断）

4.电转（NC膜、湿转）

将海绵滤纸一起放入电转液浸泡，NC膜另外取盒子用电转液浸泡，NC膜尽量用干净的镊子夹取。把夹子平铺，透明一侧在左，黑侧在右，将海绵放一片在黑侧，铺上滤纸。玻璃板在上方未对齐处撬开，小心将玻璃板取下，留下沾有胶的一块，将凝胶底部对准滤纸靠夹子连接处的一侧对齐压平，再将滤纸和玻璃板拿起，用刮片从底部先将凝胶与玻璃板分开一部分，再从这一侧将玻璃板缓慢抬起，用滴管吸取电转液加到胶上,再将NC膜光面朝着透明一侧放置放置时从左到右尽可能排出气泡，再放上滤纸，用滚筒赶出气泡，放上海绵，把夹子夹紧，放入电转槽内，放入冰块，倒入电转液，设定模式为恒流模式，300mA跑70min。

（1）干的NC膜很脆，容易开裂，浸泡后保持干净，用手拿的话手套上的杂质可能会附着在NC膜孔隙内，影响结果。

（2）凝胶易破裂，用刮片的时候需要小心，刮开一边，让其自然脱落最好。

（3）吸取电转液到胶上和用滚筒压几下都是为了赶出凝胶与NC膜之间的气泡，可以适当多加一些电转液（也可以将整个体系完全泡入电转液中操作，但是电转液中含有甲醇，需要注意通风，手套质量要好），适当加大滚筒压的时候的力度，但是力度很大时，凝胶会变形，导致一侧泳道不能完全转移到NC膜上。有气泡的情况下会有部分蛋白转移不到NC膜上，最终结果是部分条带有圆形缺失。

（4）电转产热比较多，冰盒可以多装冰，电转液也要4°C保存。电转液可重复使用，但是不建议超过三次（含有大量滤纸脱落后的絮状物）。

5.封闭

使用TBST配制5%脱脂奶粉或BSA摇床摇1h（选用脱脂奶粉会更好一些，含有各种分子量的蛋白，而BSA只含有60kDa的牛血清白蛋白，会产生高背景）。夹子黑色一侧在左，透明一侧在右，让三明治结构位于右侧，取下海绵和滤纸，用油性笔在加样孔处划线，取下胶。根据Mark位置确定并标识泳道编号，泳道编号上方对膜进行标注。将膜放入牛奶中在摇床上封闭1h。TBST摇床上清洗三次每次5-10min。

（1）牛奶配制可以在电转前配制，可以适当延长封闭时间以获得更好的封闭效果，过长会掩盖抗原表位。

（2）牛奶没有完全溶解会导致结果出现黑点。

（3）没封闭好会导致高背景。

6.一抗孵育

TBST洗完后将NC膜按需求切成条，加入一抗4°C孵育过夜。TBST摇床上洗3-4次每次5-10min。

（1）一抗的质量和浓度选择非常影响最终的结果，高浓度会使条带成一坨，低浓度会导致条带弱，不清晰。可以先用紫外分光光度计测定蛋白浓度作为参考再选择合适的浓度，但是这样也只是测出总蛋白，实际测试不是特别有效。参考浓度1：2000，其他浓度,效价低1:500-1:1000,效价高1:5000-1:10000。

7.二抗孵育

选择正确的二抗，根据说明书确定浓度并用TBST配制，倒掉清洗的TBST，加入二抗孵育1h。TBST摇床上清洗3-4次每次5-10min。

（1）二抗起到放大信号的作用，高浓度条带清晰但会高背景，低浓度低背景但是条带会弱。参考浓度1：10000-1：80000

8.显色

有多种显色方法，常用的是三种，胶片显影（压片），化学发光成像，DAB呈色。这里仅介绍化学发光成像。1:1混合发光液的A液B液加入盒中并混匀，将膜滤干放入发光液中使其完全被浸没1min左右，将膜对齐放在透明胶片上，然后盖上另外一张透明胶片压平放入化学发光成像仪中，选择合适的模式及曝光时间拍片。按要求保存所拍图片。

（1）显色全程需要弱光环境，否则影响发光液效果。

（2）发光液现配现用，虽然配制完成之后仍在几个小时有效，但是发光强度会随时间快速降低。

（3）NC膜有蛋白一侧朝下放入，一定要完全浸没，否则会出现发光不均匀等问题。

（4）曝光时间根据具体情况调整，实际所需时间1S-10min不等，强发光条带1-3S，正常发光条带30-60S，弱发光条带120S-10min。其实超过300S的曝光时间意义就已经不大了，这个时候可能需要调整一抗和二抗浓度重新做了。

9.分析

对条带分子量进行比对，根据条带强弱也可定量分析。完成报告。

（1）分子量大小往往会和预测分子量有差别，一般来讲和预测分子量相差10%以内都是正常，此处的误差来源于各种因素。

（2）定量分析可用ImageJ软件进行分析。定量分析并不准确，只能判断大致趋势。