*↑此处的探针退火温度要比引物高5-8℃。（因为引物要比探针先结合到模板上）

动物组织推荐液氮研磨的方法

浓度、纯度、完整度

↑？

↑产物长度为100-200bp时扩增效率最高。

标准曲线：模板稀释倍数和CT值作标准曲线

相对定量看内参，绝对定量看标准品

定量优先使用两步法进行

↑都有四个时期

↑红框中为基线

↑溶解曲线非单峰，有非特异性扩增

如何判断CT值的有效性？有以下6点。

↑溶解曲线单峰，有特异性产物；有杂峰会导致CT值减小。∴第二张图的CT值不可信。溶解曲线单峰方可信。

↑当复孔间标准差小于0.2时分为以上两种情况。

↑CT值要先判断是否有效再拿来计算。

↑模板浓度过高；基线期过低