图1：ATCC中293T细胞形态

293细胞中转入SV40T-ANTIGEN基因形成的高转染效率衍生株，即为293T细胞系。包含SV40-ORI的质粒能够在该细胞系中显著扩增，从而促进表达载体的扩增，促进蛋白的表达。293T细胞除了可用于各类基因表达及蛋白生产，还可用于高滴度逆转录病毒及其他病毒生产，如腺病毒及其他哺乳动物病毒。

本文为大家介绍293T的培养条件及注意事项：

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图2：293T细胞形态

一、细胞特性

细胞贴壁性较差，容易飘起来；

增殖迅速，倍增时间约为20h；

融合率不可过高，需要及时传代。

二、培养条件

• 培养体系DMEM,HIGH GLUCOSE(GIBCO CAT:11995,或同配方) +10%胎牛血清(南美级别）

• 传代比例1:3-1:5传代（培养面积比）注：可根据实验所需细胞量对传代比例进行调整，但不可过低，细胞密度太低时生长缓慢。

• 传代方式：消化30s

• 换液频率：2~3天换液1次注：培养基变黄时需及时换液。

• 冻存液配方：DMEM,HIGH GLUCOSE+10%FBS+10%DMSO

三、培养要点

1. 细胞贴壁性较差，容易飘起来，37℃静置可重新贴壁。换液时注意不要用力摇晃培养瓶，否则有可能会把细胞摇下来。

2. 细胞容易消化，消化下来的细胞容易成团，要吹打吹散。否则传代后细胞会成团生长，不均匀，影响实验结果。

3. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。

4. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等情况。所以要在细胞购进时就进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

四、常见问题

图3：客户培养的293T（仅供学习参考)

1、为啥293T细胞传代后聚团严重？

答：

● 胰酶消化操作不当导致细胞聚团。

● 消化过度或吹打过猛导致细胞受伤严重，破损的细胞碎片容易粘连聚团。

● 消化时细胞融合率太高，成片脱落，将不容易被吹散，容易聚团。

● 鉴于该细胞贴壁疏松，普通0.25%胰酶消化时间控制30s-60s；吹打动作轻柔，充分分散；细胞融合率达到80%-90%即可传代，不可长的太满。

2、为啥293T换了血清批次后聚团严重？

答：

● 血清批次间存在差异。293T细胞本身有聚团生长特性，但严重聚团可能是由于受到血清里的某些因子刺激。

● 先用血清试用装，试用效果好，可购买和血清试用装批次相同的正装，有效避免批间差对细胞的影响。

图4：客户培养的293T（仅供学习参考)

3、为啥293T细胞转染病毒后凋亡严重？

答：

● 在排查了方法步骤和转染试剂，依然没有改善的情况下，可排查一下转染前的营养体系，尤其是血清批间差带来的影响。很多同学说前期培养细胞形态正常呀，其实细胞形态学只是鉴别细胞是否健康的一个外在指标，还要结合细胞其它指标对细胞健康进行评定（比如倍增时间，存活率）。

● 通过更换血清批次，再进行转染实验并观察转染后的效果，比较分析出原因。