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说起杀手的形象，菌菌的脑海里第一反应是林俊杰《杀手》里的“杀手往往在300米之外”，远程迅速且一击致命。但对于某些疾病，它们默默地在我们身边长情陪伴。

菌菌发现，随着年龄增长，不少人会出现腿脚发冷、无力、酸痛、麻痹等症状，很多人以为是由于年纪大而出现的自然现象，其实，大家忽略了这背后沉默的杀手-下肢缺血症，近年来，吸烟的年轻化、女性化、工作人员办公室久坐也使下肢缺血症的患者趋于年轻化,这个杀手不太远，菌菌在此提醒大家警惕这个沉默的杀手! 

图1 下肢缺血性疾病

一、下肢缺血性疾病（limb ischemia）

什么是下肢缺血性疾病？下肢缺血性疾病[1]（英文名limb ischemia，简称LI）通常由动脉粥样硬化引起，造成下肢血管狭窄、闭塞，血供减少。它是一种外周动脉疾病。发病类型有慢性也有急性。慢性疾病包括下肢闭塞性动脉硬化(英文名Arteriosclerosis obliterans，ASO)、血栓闭塞性脉管炎(英文名Buerger病）、主动脉型大动脉炎(英文名Takayasu病）、糖尿病足(英文名diabetiefoot)、雷诺氏病(英文名Reynolds disease)等，急性LI多由动脉栓塞或下肢动脉急性血栓所致。最终会发展成重症肢体缺血(英文名critical limb ischemia，简称CLI)。

图2 下肢缺血示意图

该类疾病主要的临床表现为行走能力下降、静息痛和溃疡等，具有发病率高，致残率高和治愈率低的特点，而且如果不及时进行治疗很可能会发展成重症肢体缺血。重症下肢缺血与心血管疾病引起的心肌梗塞、中风和死亡风险增加相关，患者往往需要截肢，其截肢率最高可达40%，年化死亡率超过20%。国内，该疾病的发病风险人群众多（吸烟人口超3.16亿，糖尿病患者约为1.14亿，高血压患者超2.7亿，血脂异常人数为1.6亿），并随着人口老龄化进程，中国的患病人数呈增长趋势。2017年美国研究机构发布的最新报告预测，中国CLI患者约为560万~630万人。可见，重症肢体缺血会导致生活质量差、死亡率高、加重了社会经济负担。

图3 严重下肢缺血性疾病临床表现

二、下肢缺血性疾病的治疗方式

目前世界范围内尚无有效治疗CLI的药物问世，临床上主要通过外科经皮介入及搭桥手术的方式进行血管重建治疗。但受限于严格的手术适应症、血管条件等原因，部分患者无法接受血管重建术治疗，且存在术后再狭窄、病情反复等问题。随着人口老龄化趋势以及高血压、高血脂、糖尿病及吸烟等暴露在相关疾病风险的人群不断增多，CLI患者数呈增长趋势，该领域存在着显著的未满足医疗需求。

传统治疗手段

该疾病缺乏有效的治疗手段。目前疾病早中期治疗方法有Fontaine法和Rutherford法，发展到最终阶段时则无药物治疗可供选择。现有的治疗常用的药物主要是抗凝和抗血小板治疗药物，以及各种促进血管扩张和侧支循环形成的药物，前列环素类药物时、保达新等。现有手术治疗包括间接改善下肢血运的手术（包括大网膜铺植术和腰交感神经节切除术）、动脉旁路移植术、动脉切开取栓术、动脉内膜剥脱术。血管腔内介入治疗因微创、可重复进行，部分过去需行动脉旁路搭桥的手术逐渐已被腔内介入治疗所替代。尽管现在医学技术取得了突出进步，但是传统手术对患者条件要求高、手术风险高以及血管介入不良等诸多因素，仍有超过30%的患者不满足血运重建的要求，导致了这类疾病的临床干预效果未能满足长期的结果预期。随着人口老龄化趋势以及高血压、高血脂、糖尿病及吸烟等暴露在相关疾病风险的人群不断增多，重症下肢缺血的患病人数逐年攀升，而目前尚无完全治愈的药物，临床干预上形成了庞大的缺口。当前急需创新方法来扩大血管再生，以拯救生命和患者的四肢，从而提高整体的生活质量。国内现有下肢动脉缺血患者超过 3000 万，对中老年人的身体危害极大。目前，下肢动脉缺血性疾病尚无能彻底治愈的药物。基因治疗或许在将来成为最佳的选择。有业内人士根据 3000 万患者基数进行测算，重组肝细胞生长因子质粒市场规模达到30亿元左右。

图4 注射液

目前中国针对下肢缺血症，相关在研前沿1类新药有诺思兰德的重组人肝细胞生长因子裸质粒注射液（NL003）[2]以及人福医药的重组质粒-肝细胞生长因子注射液等。以下，菌菌仅以诺思兰德NL003项目为例，浅析现代前沿生物医学的神奇原理！ 基因疗法用于下肢缺血性疾病的临床研究裸质粒本身可以用于开发DNA疫苗和治疗疾病的药物，也是mRNA基因药物、细胞治疗、CAR-T等基因治疗药物的基本原料，在基因治疗领域具有广泛的用途。由北京诺思兰德生物技术股份有限公司研发的基因治疗药物“重组人肝细胞生长因子裸质粒注射液”（NL003）治疗严重肢体缺血（CLI）的II期临床研究结果发表于《Molecular Therapy》第27卷，第12期（2158-2165页）[3]。该临床研究获得两次国家“重大新药创制”立项支持。

图5 诺思兰德产品管线图

《Molecular Therapy》由美国基因与细胞治疗学会主办，主要发表分子治疗领域的重大研究成果，其2018年度影响因子为8.402。

图6 文章《肝细胞生长因子治疗危重肢体缺血的随机、双盲、安慰剂对照II期研究》

NL003是一种利用生物工程技术制造的可同时表达两种肝细胞生长因子亚型的质粒。这项临床Ⅱ期研究目的是评价局部肌肉注射NL003治疗严重肢体缺血(CLI)的安全性和有效性。该研究采用随机、双盲、多中心、安慰剂对照的设计，在国内9家研究中心随机共入组200例CLI受试者，其中，高、中、低剂量组与安慰剂组各入组50例，试验观察期为180天，主要终点指标为疼痛完全消失率及溃疡完全愈合率，并评价不良反应。

图7 病人登记表2例患者自愿退出研究，未给药。一名患者在第一次给药后因为无法确定年龄而退出研究。

三、临床试验结果

静息痛的缓解：静息痛是肢体在静止状态下的疼痛，是血管性病变的中期表现, 静息痛是严重影响CLI患者生活质量的重要临床症状。在第0,14,28,60,90和180天使用视觉模拟评分（VAS）测量静息痛的水平。给药后的疼痛评分变化（VAS）上，试验药组均有显著的疼痛减轻趋势，从给药后的第60天开始与安慰剂组比较具有统计学差异（p<0.05）。

图8 疼痛评分（VAS）较基线的变化值

疼痛完全消失率：患者注射后第180天评估患者在停用镇痛药时完全疼痛减轻的患者比例，第180天在不服用镇痛药前提下的静息痛完全消失率上，低、中、高剂量组分别达到48.94%、56.25%、54.17%，显著优于安慰剂组的6.38%，并具有统计学差异（p<0.05）。

图9 第180天疼痛完全消失率

溃疡完全愈合率：第180天的溃疡完全愈合上，试验药组均优于安慰剂组，其中高剂量组达到66.67%，与安慰剂组的27.27%比较具有统计学差异（p=0.0243）。

图10 给药后6个月时溃疡的愈合情况

该杂志同期发表了由主任编辑Seppo Ylä-Herttuala博士署名的一篇题为《治疗CLI的基因治疗进入临床应用》[4]的社评，对于本次发表的试验结果给予了积极评价。笔者认为：“CLI是一个重大的世界性健康问题，在研药品能在随机、盲态、对照研究中得到确切的阳性结果具有非常重要的意义，虽然在作用机理及临床给药策略等方面还有尚待验证的问题，本次发表的HGF裸质粒基因治疗研究结果给予那些临床上无合适治疗手段的患者带来了希望”。

图11 文章《危重肢体缺血基因治疗进入临床应用》

四、作用机理

NL003作用机理: NL003是以高效的pCK载体与改构的人HGF基因序列构建的裸质粒基因治疗药物，在患肢的缺血部位肌肉注射后，通过骨骼肌细胞转染，可同时表达分泌出人体内天然存在的两种HGF723与HGF728蛋白异构体。HGF蛋白可促进血管内皮细胞的增殖与迁移以及动脉平滑肌细胞的迁移，从而促进缺血部位的血管新生，建立微血管网侧支循环通路，达到治疗肢体缺血性疾病的目的，可用于治疗严重下肢缺血性疾病（CLI），也可用于糖尿病周围神经病变（DPN）等。

图12 NL003作用机理

诺思兰德重点在研的新药NL003（重组人肝细胞生长因子裸质粒注射液）是一款基因治疗药物，主要用于治疗严重下肢缺血性疾病，包括静息痛和溃疡患者，也可进一步开发间歇性跛行的下肢缺血性疾病适应症。该项目入选国家“十一五”、“十三五”重大新药创制项目，目前处于Ⅲ期临床试验阶段，产业化生产之路也不再遥远，对饱受病痛折磨的患者已如划破黑夜的曙光，温暖阳光已不在遥远。随着此类药物的成功突破，对于临床上无合适治疗手段的患者，未来将有更多的治疗方案可供选择，远离病魔的概率将不再渺茫！

图13 基因治疗药物

耀海生物制剂生产服务：

耀海生物可提供符合GMP要求的自动化无菌生产线，为集洗瓶、（烘箱）灭菌/除热原、灌装、冻干、轧盖等多工序为一体的高科技生产线，其中产品（及包材）暴露区域均采用O-rabs系统进行A级环境保护，冻干进出料过程采用自动化进出料系统，冻干机清洗及灭菌采用CIP/SIP系统自动完成，完全规避人员干扰，整线无菌保障性能先进、可靠。同时灌装线配备了在线充氮系统，可实施产品生产过程氮气保护，对终产品的残氧量指标可有效控制。可为客户提供冻干工艺开发及处方研究、1-25ml多规格西林瓶水针及冻干粉针剂型生产服务，其中西林瓶水针年产量可达1000万支，西林瓶冻干粉针剂年产量可达500万支、预灌封/卡式瓶年产量可达300万支（1ml、3ml）。

参考文献：

[1]https://baike.baidu.com/item/%E4%B8%8B%E8%82%A2%E5%8A%A8%E8%84%89%E7%B2%A5%E6%A0%B7%E7%A1%AC%E5%8C%96/7675045. [2]杨川, 郭发才, 周栋. 重症下肢缺血治疗的研究进展[J]. 重庆医学, 2015, 000(004): 544-547. [3]http://www.northland-bio.com/. [4]Gu, Y., et al., A Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Phase II Study of Hepatocyte Growth Factor in the Treatment of Critical Limb Ischemia. Mol Ther, 2019. 27(12): p. 2158-2165. [5]Ylä-Herttuala, S., Gene Therapy of Critical Limb Ischemia Enters Clinical Use. Mol Ther, 2019. 27(12): p. 2053.

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