注意事项：

1.oligo d(T)有3端的偏好性，会导致CT值偏小，后续实验不可以单独使用Oligo d(T)的引物。

2.gDNA有残留会将导致3个CT的差别。

3.产物长度：100-200bp，才能达到100%的扩增效率，才能带入到公式中使用。

4.引物有效性的验证：有效性和扩增效率，将模板进行梯度稀释。

熔解曲线：单峰

扩增效率：稀释倍数与CT值的标准曲线计算扩增效率（90%-110%之间）

5.cDNA不能测浓度，不能纯化。

6.cDNA稀释多少浓度进行稀释：

7.加上对照：

8.实验结果分析下机数据：

①常用名词：

• ROX:不同仪器需求不同

• 扩增曲线：线性图谱和对数图谱。

基线期：荧光背景阶段

指数增长期：适用于公式的时期

线性增长期

平台期

基线：背景或者噪音，机器默认的

阈值，阈值线：我们可以最低相信的荧光信号

CT值：与阈值的交点的横坐标

熔解曲线：描述双链DNA解链时荧光强度变化过程的曲线。PCR反应完成，仪器升温，解链，荧光信号下降。要求溶解曲线单峰。

CT值有效性的判断：

1.溶解曲线单峰。如果不是单峰，有非特异性扩增的污染导致曲线上升。

2.复孔间重复性不好

3.NTC有污染，NTC的CT与目的基因大3个或者5个循环。

4.NRT的基因组残留可以忽略

5.合理设置阈值，放在指数增长期，放在中间，接近于直线的区域

6.内参中的e相近于1，才可以计算。

总结：不是所有的CT值都能拿来计算。

②计算方法：

③F&Q

基线选高了：

程序设置错了