SARS-CoV-2的药物开发，在全球新冠病毒大流行期间，可以挽救数百万人的生命，尤其是针对病毒复制相关的抑制剂的开发。2022年2月发表在JACS上的文章，介绍了2种虚拟筛选策略，通过使用超大型库化学库来寻找SARS-CoV-2的Mpro抑制；过程中涵盖了分子对接、测试、晶体筛选等，阶段性成果为逐层筛选出“nM级别&良好的体外药代特征&广谱”的非共价蛋白酶抑制剂。下面进行细述。

1研究背景

SARS-CoV-2，为当下最严重的健康危机，已导致全球超过500万人死亡。尽管针对COVID-19的疫苗接种意义深远，但抗病毒药物对于未来的冠状病毒爆发可能更加重要！尤其是对于一些SARS-CoV-2变体，疫苗已呈现出较弱的抵抗趋势，这就更加强烈的需要抗病毒药物来进行长期的对抗。与普通感冒病毒相似，SARS-CoV-2将持续传播并对社会造成重大威胁，这就更需要抗病毒药物来治疗已感染的患者，并预防性的使用药物来保护高危人群。2020年初，全球将药物研发的主要精力投入到抗新冠病毒药物的开发，首先是利用已批准药物筛选出潜力较大的几个候选品种，但在更大规模的临床试验中，大多数候选（如瑞德西韦和羟氯喹）对死亡率/住院时间几乎没有统计学意义。此时，在SARS-CoV-2基因组编码蛋白中，主要蛋白酶(Mpro)受到了较为广泛的关注，抑制Mpro可以阻止病毒RNA的翻译，从而阻止SARS-CoV-2的复制。靶向蛋白酶，一直是治疗人类免疫缺陷和丙肝病毒感染的成功策略，但由于Mpro在结构和机制上不同，因此需要为冠状病毒开发新的抑制剂。在COVID-19大流行之前，已经确定了几种通过共价（例如GC376）或非共价机制（例如ML188）靶向冠状病毒Mpro的化合物，但都存在一些由结构所带来的成药性差的问题，继而对结构进行优化，发现了一些新型的非共价Mpro抑制剂。

商业化合物库的规模正在迅速增长，目前可从化学品供应商处获得超过100亿个按需制造的分子。这些化合物可以很容易地合成以及测试活性，但需要开发一个筛选化合物的有效策略。SARS-CoV-2蛋白晶体结构的测定，使虚拟筛选得以实现，对接算法可以很容易的介入其中，且不局限于现有化合物。合成并测试一小部分得分较高的化合物，对接筛选可快速找到先导化合物，不过仅有一小部分筛选方法实现了预测+实验测试。

本稿件介绍的课题组通过2种不同策略，以寻找Mpro抑制剂：

1）将一个包含数亿种不同类的化合物库与Mpro的活性位点进行对接，并选择排名靠前的化合物进行试验评价；

2）通过创建包含数百万化合物的库来优化晶体筛选中识别的片段。

最终，上述2种方法都得到了预期的化合物，且最有潜力的先导化合物与先前确定的Mpro抑制剂进行了比较，这其中包括临床候选关注度极高的药物PF-07321332，从而证实了在超大型化学空间中寻找药物先导的有效策略。

图1.1 两种虚拟筛选方法的简要介绍

2方法一：超大库用于Mpro抑制剂的对接

第1种虚拟筛选，将2.35亿个化合物与Mpro蛋白进行对接，晶体结构对应的共晶底物为X77（PDB代码：6W6325）。X77（外消旋体）是一种Mpro抑制剂，KD常数为1.9μM，IC50为2.8μM，可占据活性位点的4个主要口袋（S1、S1'、S2和S3）。库中的每种化合物都在Mpro活性位点以数千个构象进行采样，并使用DOCK3.7评分功能评估了＞223万亿个复合物。后通过拓扑相似性对300000个排名靠前的化合物（对应于库的0.12%）进行聚类；进而从5000个排名靠前的集群中，根据对活性位点互补性的目视检查，选择了82种化合物进行实验评估。同时，在3000个排名靠前的化合物中选择了另外一组18个分子，它们与X77形成相同的氢键组，即His163、Glu166和Gly143。去除化合物的因素包括配体应变、结合位点残基、化合物的不满意极性原子，以及不太可能的互变异构/电离状态。上述选择的100种化合物在Mpro中进行了酶抑制测试和直接结合相互作用测定（3个浓度组5、15-20和50μM）。表2.1中给出了筛选结果较好的分子及其数据，其中，乙内酰脲结构、吡啶基乙内酰脲结构、吲唑-4-羰基结构可关注。

图2.1 虚拟筛选-分子对接/得到的Hits

3方法二：基于片段的虚拟筛选&Mpro抑制剂

第2种筛选方法，即基于片段的虚拟筛选。首先选择了24个已识别的活性位点结合片段中的1个作为进一步研究的起点，晶体结构的PDB代码为5RF7。与较大的抑制剂X77相比，化合物4占据了S1和S2口袋，但没有延伸到S1'或S3中。计算得KD>200μM，且在50μM时对酶活性没有影响。

图3.1 基于片段的虚拟筛选结果

PS：基于片段的虚拟筛选，是通过在一个库中搜索＞100亿个按需制造的化合物以及对接环境来选择最佳候选底物，基于对复合物的虚拟分析，设计了可以包含片段极性相互作用的关键特征的化学模式，同时具有将结构探入到入S1'和S2口袋的潜力。结果显示，一个五元芳香杂环和一个分别与His163和Glu166形成氢键的酰胺骨架结构，至关重要；不过，S1口袋中杂环的大小和拓扑结构允许变化。另，研究者还尝试了S2口袋中可用的支链和酰胺结构。最终发现，约5000种化合物保持核心结合模式，具有良好的对接分数；进一步进行目视筛查，选择了93种化合物进行实验评估。另，选定的化合物探索了多种杂环，以优化与S1口袋以及S2和S1'口袋中的脂肪族和芳香族化学基团的氢键相互作用。SPR生物传感器实验中，21个精细片段显示出剂量依赖性结合，其中5个还显示出50μM浓度条件下的Mpro抑制活性（<70%活性，化合物5-9）；两种测定中确认的5次命中，通过SPR生物传感器测量确定的KD值范围为7.2~79μM；化合物5在酶测定条件下的IC50为20μM，在SPR测定中的KD为7.2μM；且综合来看，化合物5、6和8的复合物晶体结构均以1.6Å的分辨率成功测定。晶体结合模式证实了对接预测，RMSD分别为1.3、1.5和1.4Å。

图3.2 通过高分辨率晶体结构确认预测的结合模式

4基于结构的优化

以上述虚拟筛选确定的3个骨架为基础，同时以对接预测结果和晶体结构进行指引，继而购买和合成，得到具体的化合物，实现了快速测试的目的，即~在4个月的时间内，得到了nM级别的Mpro抑制剂。基于化合物1和化合物3骨架结构，以及晶体结构进行结构优化：其共同的乙内酰脲骨架与蛋白的活性位点可以显示出很好的氢键作用。商业库包含4300万个乙内酰脲结构，通过检索确定了具有试验价值的候选结构，并通过几个循环，系统的探索了S1和S2口袋的变化，以确定取代基的最佳组合，但也确定了＞20w个可能结构。基于此，对137种妥因结构进行了试验评价，初步证实S1口袋中化合物1的吡啶基可以增强效力、与芳香氮相邻的位置的取代基不利于活性，且基于吡啶结构的化合物1的衍生物的活性可以从50μM逐渐改善到化合物10、11、12的18、7.5、1.3μM，吡啶结构也逐渐延伸到异喹啉结构，且为该方向的最高活性。S2口袋中，从化合物3的螺环类似物中逐渐筛选出更优的取代基（如化合物14、15），预测结合模式也得到了晶体学的数据支持，化合物14、15的的螺-丁基结构的IC50值提高到了8.3和6.9μM，SPR生物传感器测量证实了化合物15与Mpro相互作用（KD=6.6μM）。通过S1和S2两个口袋中取代基的最佳组合，合成并确定化合物16和17，IC50值分别为0.46和0.33μM，KD值分别为0.14和0.15μM，晶体结构（2.2Å分辨率）也支持化合物17的异喹啉和乙内酰脲环的预测相互作用。详见下图。

图4.1 基于S1和S2口袋的“hit-to-lead”结构优化

对化合物16/17的脂肪尾部进一步优化，引入苯环~与化合物18的活性相似，并可以进一步优化~化合物19的IC50为0.077μM/KD为0.038μM。PS：酶抑制试验中，GC376和PF-07321332的活性分别为0.073和0.033μM。综上，通过虚拟筛选，化合物1~19，受体-配体亲和力提高了600倍以上，已具备用于药物发现的先导化合物的基本特征（含理化特性）。

图4.2 化合物18~19的结构探索

在上述的结构中，还有一个化合物2。通过使用与化合物1和3的相同策略，以苯基哌嗪骨架进行优化测试了67种化合物，发现化合物20的IC50为7.2μM，并综合商业来源化合物的分子对接结果，尤其是化合物5和8的特征，加以79种市售化合物，得到了化合物21~IC50为2.1μM，晶体结构证实了S2口袋中预测的相互作用。对于化合物20和21，由SPR生物传感器测定确定的KD值分别为4.7和2.3μM。

图4.3 复合/化合物21的Mpro的晶体结构

5评估是否存在共价抑制

为了评估是否涉及半胱氨酸残基的共价作用，研究者在还原剂二硫苏糖醇（DTT）存在下对几种发现的化合物进行了测定；添加DTT不会改变化合物16-21的IC50值。另，添加去污剂对Mpro进行了额外的酶促测定，以控制由于胶体聚集引起的混杂抑制；IC50值对TritonX-100的存在不敏感。化合物16-21对人组织蛋白酶S活性没有任何影响（IC50>50μM），但拟肽GC376和PF-07321332的IC50为0.002和5.7μM。为了进一步评价骨架结构的选择性特征，测试了化合物19对其他9种人类蛋白酶的抑制活性，结果显示：化合物19在10μM浓度下对这些抗靶标没有显示出显着的抑制作用，且连同SPR生物传感器测定，综上表明筛选的化合物是非共价和选择性Mpro抑制剂。

6细胞试验&体外药代

抗病毒试验所使用的细胞为感染SARS-CoV-2病毒的细胞，以此对化合物进行活性评价。化合物16、17、19显示了对细胞病变活性的剂量依赖性抑制，EC50值为1.7、1.6和0.077μM，并且在VeroE6细胞中的最高测试浓度下没有显着的细胞毒性。同时，使用RT-qPCR来评价化合物对病毒复制的抑制活性，EC50值分别为1.0、0.9和0.044μM。而之前报道的Mpro抑制剂GC376、ML188和X77也是基于细胞病变效应来测定的，共价拟肽GC376和非共价抑制剂ML188、X77显示出抗病毒作用（在VeroE6细胞中，EC50分别为4.4、14.1和34.3μM），但活性弱于化合物16、17、19。辉瑞当前极火的药物PF07321332，在Huh7细胞中进行的基于CPE的测定，与化合物19显示了相当的效力，EC50值分别为0.08和0.11μM。为进一步评价化合物19作为开发广谱冠状病毒药物的Hit的潜力，通过计算模拟，将化合物19与29个已报到的Mpro活性位点突变体和SARS-CoV-1和MERS-CoV晶体结构的同源模型进行对接，化合物19的结合模式在所有预测的复合物中都保持不变，这初步证实化合物19可能对其他冠状病毒均具有活性；且通过试验，证实了化合物19存在SARS-CoV-1（EC50=0.39μM，VeroE6细胞）和MERS-CoV（EC50=0.20μM，Huh7细胞）的细胞病变效应。为了进一步了解化合物19的成药性，还对其ADME特性进行了研究，发现其在人肝微粒体试验中代谢相对稳定（清除率CLint=22μL/min/mg），人血浆中的血浆蛋白结合（fu=3.3%）。Caco-2方面，化合物19体现了较好的高渗透性（PappAB=5.9×10-5cm/s和PappBA=5.0×10-5cm/s），未观察到外排效应（外排比为0.8）。

图6.1 化合物19和参比抑制剂的细胞测定数据

7小结

通过超大型库虚拟筛选，对SARS-CoV-2抑制剂的研究，主要有以下发现：1）商业化数十亿种化合物的筛选库，通过分子对接确定了8种Mpro抑制剂，且其中5个结构，通过晶体学得以证实结论；2）通过晶体结构和数十亿虚拟化合物的搜索，实现了高效的先导优化，继而产生了3个系列的非共价抑制剂；3）最有潜力的先导在Mpro酶测定中具有纳摩尔IC50值、良好的体外ADME特性，并在细胞测定中显示出对几种冠状病毒的广谱活性作用；4）筛选方法展现了非常高效的化合物命中率，且两种方法的结合成功的导向了先导化合物的优化；5）针对于这类结构，超大库的分子对接测试，先于重点子集的研究，如此可以获得更多的不同的线索。

参考文献：1.Ultralarge Virtual Screening Identifies SARS-CoV‑2 Main Protease Inhibitors with Broad-Spectrum Activity against Coronaviruses. J. Am. Chem. Soc. February 10, 2022. doi.org/10.1021/jacs.1c084022.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c08402?goto=supporting-info

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