观测线粒体自噬之前，先了解什么是线粒体自噬mitophagy？

线粒体自噬是一种选择性清除多余或受损线粒体的自噬过程, 在调节细胞内线粒体数量和维持线粒体正常功能等方面发挥重要作用，研究表明线粒体功能紊乱与神经退行性疾病有关。

损伤线粒体-自噬体-溶酶体

The selective degradation of mitochondria by autophagy (mitophagy) is a process whereby damaged mitochondria are sequestered into double-membrane vesicles called autophagosomes and transported to lysosomes for degradation. 

线粒体自噬的4个过程：

1.受损伤的线粒体会去极化，膜电势下降；

2.线粒体被自噬体包裹形成线粒体自噬体；

3.线粒体自噬体与溶酶体融合；

4.线粒体被溶酶体降解。

 摘自 https://www.jianshu.com/p/db873260ef3c

激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像。confocal显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量，配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。

观测线粒体自噬的常用荧光染料：

线粒体膜蛋白Tom20 (mitochondria) 

自噬体蛋白LC3B (autophagosome)

溶酶体蛋白LAMP2（Lysosome）

RFP-mito provides an easy way to label mitochondria with red fluorescent protein (RFP) in live cells.

MTG (MitoTracker green)可以示踪线粒体

LTR (LysoTracker red)可以示踪溶酶体

无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体。

正常情况下线粒体在细胞内呈网状或线状分布，线粒体自噬时会断裂成点状。溶酶体在细胞内呈散点状分布。

confocal拍照时，只需要选出单个细胞进行观察。

下面这篇文章就是利用上述染料来观察线粒体自噬过程（DOI 10.1074/jbc.M109.035584）

图1：自噬体（绿）与线粒体（红）共定位

图2：线粒体（绿）与溶酶体（红）共定位

共定位说明什么？

红色和绿色荧光merge后形成黄色荧光，图1和图2中黄色荧光颗粒分别表明线粒体与自噬体的融合过程，线粒体自噬体与溶酶体的融合过程。

黄色颗粒越少，说明线粒体自噬的过程受到了抑制。