这篇是厦门大学的吴乔教授发表在cell research上的文章，有幸拜读，做了ppt来学习这篇文献，课题组有讲文献的周会，以前记笔记在本子上，后来觉得不方便，干脆传到b站当一个云笔记吧，本人水平有限，对这篇文献学习得尚不充分、全面，如有错误欢迎指正。侵权立删。
Caspase-3/GSDME焦亡通路在肿瘤化疗领域具有重要意义
这里关于焦亡时形成的小孔，有不少文献说1-2nm，但另一篇文献（https://www.nature.com/articles/nature18629）测量得出15nm，恳请大神解惑。
细胞焦亡在肿瘤药物化疗方面扮演了重要角色，目前黑色素瘤对某些化疗药物开始产生了耐药性，该文献对这一问题提出了一种新思路。
研究过程一般是两头到中间
已有文献证明铁通过提高活性氧(ROS)和参与细胞死亡模式引发氧化应激，但关于铁升高的ROS与焦亡的关系尚未有文献报道
首先明确铁在各种氧化应激药物预处理中扮演了怎样的角色。敲除铁蛋白上调胞内Fe并联合各种氧化应激药物预处理观察黑色素瘤细胞形态、活力变化
上调Fe依赖性ROS后，细胞活力明显下调
检测细胞焦亡需要多个指标，下面仅列举部分结果。黑色素瘤细胞焦亡视频请点击
图中红色箭头所示的胀大的有空泡结构的细胞即焦亡细胞
在上诉药物中筛选出CCCP，进一步完善焦亡指标
焦亡细胞胞膜是破裂的，LDH会释放出来，LDH释放率是焦亡指标之一。DFO是铁螯合剂，下调Fe后，CCCP预处理的敲除Fe蛋白的黑色素瘤细胞焦亡数目也下调了，这说明了内源性Fe在CCCP诱导焦亡中的作用。
添加外源性2价铁观察变化
气泡中的文字来源于文章内容
3价Fe进一步验证。焦亡执行分子蛋白GSDME被上调
分别敲除GSDMD、GSDME观察细胞变化，最终确定Fe参与CCCP诱导的细胞焦亡是Caspase-3/GSDME途径（相关实验数据见期刊官网补充材料）
为了确定Fe参与的CCCP诱导细胞焦亡是否为一种普遍现象，文章换用其它几种细胞，结果一致。因此得出第一条结论：铁上调ROS诱导黑色素瘤细胞焦亡。
线粒体是ROS产生的主要场所，接下来文章就开始线粒体方面的研究。Parkin可以通过介导线粒体自噬参与对细胞内受损线粒体的清除，将Parkin转进胞内，达到耗竭线粒体的目的。
Tom(线粒体外膜转位系统)包括一个核心亚基Tom40、两个外周亚基Tom20,Tom70、三个较小亚基Tom5,Tom6,Tom7和位于中央位置的Tom22。
结果表明耗竭掉线粒体后抑制了细胞焦亡。
Hsp60：分子伴侣，位于线粒体中。铁和CCCP联合处理使得线粒体聚集，细胞色素c上调，抗氧化剂降低ROS，线粒体聚集减少，细胞色素c下降，发挥保护作用。
铁和CCCP联合处理激活Caspase-3、9，上调内源性铁可以促进Caspase-3、9的激活。
Caspase-3而不是其它Caspase家族成员激活了GSDME诱导焦亡（见官网补充材料），敲低Caspase-3、9就抑制了细胞焦亡。
且该焦亡可被Caspase抑制剂ZVAD所抑制。因此得出第二个结论：铁扩大的ROS信号可作为促进线粒体聚集和细胞色素c释放的上游因素来活化Caspase-3激活GSDME进而诱导黑色素瘤细胞焦亡。
既然Fe扩大的ROS信号促进细胞色从线粒体释放到胞质中，那么线粒体外膜上的某些蛋白质可能发挥了重要作用。其中，Tom蛋白引起了作者的注意。
联合用药处理后，发现Tom20,Tom40蛋白表达水平显著升高，且呈时间依赖性。
敲低Tom20后，细胞焦亡也被抑制。
敲低Tom40却没有显著抑制细胞焦亡，以上说明Tom20参与了Fe,CCCP诱导的焦亡。
使用Caspase抑制剂后不影响Tom20的积累，说明Tom20可能是Caspase-9/3的上游因素。免疫荧光实验结果显示，敲低Tom20后，线粒体聚集受到抑制，而且升高的ROS信号不受敲低Tom20的影响，（见官网补充材料）；以上结果说明Tom20作为上游调控因子影响线粒体聚集和细胞色素c释放。即得出第三条结论：Tom20感知并传递ROS信号给线粒体。
ROS经常通过氧化半胱氨酸来调控蛋白质功能，在这一过程中分子内或分子间形成二硫键。作者采用非还原性SDS-PAGE凝胶跑电泳来分析Tom20的变化。（其中检测不到Tom40的寡聚体）
oligomer寡聚体，monomer单体
以下关于这第四点结论的实验是我的知识盲区，也没做过这方面的实验，当时讲的时候，老板解释了一下，我还是没听懂...以后找时间补回来。
即得出第四点结论：ROS诱导Tom20氧化促进细胞焦亡。
文献报道，Tom20氧化对Bax线粒体定位很重要，可诱导细胞色素c的释放。因此作者想知道这在Fe和CCCP联合处理诱导的焦亡中是否是一致的。免疫荧光结果显示，Bax明显从胞质向线粒体转位。敲低Tom20后检测线粒体膜蛋白，Bax表达下降。这表明Bax对CCCP/Fe的响应依赖于Tom20的线粒体定位。
敲低Bax,线粒体聚集水平下降，细胞色素c释放减少，细胞焦亡受到抑制。
接下来又是知识盲区，Bax和Tom20的这种相互作用依赖于Tom20的氧化，因为突变掉Tom20的氧化位点后，这种相互作用就不受CCCP/Fe调控。结合CCCP/Fe不影响Tom20线粒体位置(见官网补充信息）作者提出被氧化的Tom20与Bax线粒体相互作用并招募Bax到线粒体，即铁诱导的Tom20氧化将Bax招募到线粒体，从而促进Bax依赖的细胞色素c的释放，并导致黑素瘤细胞的焦亡。
作者在其它线粒体焦亡模型中重复了研究，发现Tom20氧化可能也适用于其它线粒体介导的细胞焦亡。
在证实了铁可以放大ROS信号从而诱导细胞焦亡后，作者进一步研究了铁是否可以使黑色素瘤细胞对激活ROS的药物更加敏感。
选用几种临床药物，其中，柳氮磺胺(SSZ)、丁硫氨酸亚砜胺(BSO)、BAY 87-2243(BAY)、异硫氰酸(PEITC)、依他尼酸(EA)等均可轻度上调a375细胞内ROS水平，而铁的共处理可显著放大ROS水平的升高(见官网补充信息，图S6a)。这些数据突出了一个新概念：铁可以在这些ROS上调药物诱导焦亡中充当敏化剂。
作者在不同药物中也开展了大量研究，此处就不一一列出了，详见官网补充信息。
以上是作者在细胞水平开展的研究，接下来的实验就从小鼠水平上进行。
为了进一步研究铁在体内对SSZ的增敏作用，作者在A375细胞驱动的异种移植瘤裸鼠体内单独或联合不同剂量的SSZ或右旋糖酐铁溶液(ID，人类常用的治疗铁缺乏症的药物)给药。SSZ仅轻度损害肿瘤生长，ID单独给药对肿瘤生长没有影响，即使浓度为10 mg/kg(补充信息，图S7a)。而SSZ与不同剂量ID联合治疗可显著降低肿瘤体积和肿瘤重量。
重要的是，低剂量的ID (2 mg/kg)足以使SSZ的抗肿瘤效果最大化，而且这个剂量的铁通常用于治疗缺铁患者，远远低于导致铁过载的剂量。此外，铁的这种作用在黑色素瘤转移小鼠模型中也可以观察到，SSZ/ID治疗显著降低了注射入裸鼠尾静脉的A375细胞的肺转移。可见，铁与临床药物具有协同抑制肿瘤生长的作用。为了检验铁/SSZ的抗肿瘤作用是否与焦亡有关，分别用A375细胞和GSDME敲除的A375细胞在裸鼠中产生异种移植瘤。与对照组PBS组相比，SSZ/ID共处理显著降低了A375细胞驱动的肿瘤生长，同时GSDME活化增加。然而，GSDME敲除后，SSZ与ID的注射不再能抑制异种移植瘤的生长。因此，Fe在ROS诱导药物激活Caspase-3/GSDME途径诱导黑色素瘤细胞焦亡的治疗中充当敏化剂。
据报道，焦亡是多种化疗药物在正常组织中引起的副作用的重要原因，包括各种组织损伤和体重减轻。的确，当小鼠被5-氟尿嘧啶(5-FU)治疗时，明显观察到严重的结肠炎伴小肠隐窝丧失、广泛的结肠缩短、脾脏萎缩和体重减轻。然而，这些副作用在SSZ和ID联合治疗的小鼠中几乎没有检测到，表明小鼠对这种联合治疗有更好的耐受性。总之，目前的研究不仅证明了铁作为体内激活ROS的药物的增敏剂，而且表明补充铁可能是一种有前途的黑素瘤患者的联合治疗策略。
这篇文献不懂之处还有很多，有些实验技术自己没接触过，现在我还只是阅读了它的一点皮毛，后续还得反复阅读。这是我第一次讲SCI文献，值得纪念，哈哈。以前看SCI文献只是看了摘要就不看了，这次借着讲文献硬逼着自己从头看到尾，收获很大，自此，我终于彻底明白了罗老师耳提面命般地告诫我们要多看文献，我也时常告诉自己和身边的学弟学妹们，文献是提高科研能力最快的方法。我知道我目前阶段的科研还只是小打小闹，等到了研究生阶段到了更大的实验室平台，那时候的科研应该更好吧，希望那时候自己不要焦虑，哈哈，实验狗，Fighting ！
