在单细胞转录组研究中，我们常常想知道：如果某个基因被“关掉”，细胞会发生什么变化？哪些通路会被激活？哪些基因表达会随之上升或下降？过去，这类问题只能靠实验敲除来验证，成本高、周期长。现在我们可以在计算机中对任意基因进行“虚拟敲除”，无需基因编辑、不用细胞培养，仅靠野生型scRNA-seq数据，电脑/网页一键模拟基因缺失，精准预测下游调控、细胞命运与功能通路，今天就梳理一下主流虚拟敲除方法。
一、GRN网络扰动法：科研发文主流首选scTenifoldKnk
核心原理
首先用单细胞数据构建细胞特异性基因调控网络（scGRN）见图1，算出基因间的互作权重，然后虚拟KO目标基因，切断目标基因全部上下游调控连接，模拟基因完全功能缺失。最后通过流形对齐对比敲除前后网络差异，筛选表达/调控显著改变的下游基因与通路。scTenifoldKnk是目前最常用的虚拟KO工具之一，专门适配单细胞稀疏数据，可用的版本有R/Python/MATLAB，R语言生信最常用。
参考网址: https://github.com/cailab-tamu/scTenifoldKnk
图1：scTenifoldKnk 原理流程图
示例结果
如图2所示，以Trem2野生型（Trem2⁺/⁺）和敲除型（Trem2⁻/⁻）小鼠的小胶质细胞分别进行scRNA-seq测序分析，仅对野生型数据开展虚拟敲除，与真实KO结果交叉验证。从核心调控网络来看，右侧网络图清晰展示了Trem2的调控关系，其下游显著扰动的基因主要富集于阿尔茨海默病通路、氧化磷酸化、溶酶体、胆固醇代谢等功能模块，富集分析显示，Trem2敲除后这些通路的表达模式发生显著改变，和实验中真实敲除Trem2后功能的改变保持一致。
图2：scTenifoldKnk 模拟敲除基因后结果示意图
优缺点
优势：生物学解释性最强、亚群拆分友好、发文认可度高、适配稀疏scRNA-seq数据，可批量处理多个基因；
劣势：依赖GRN构建质量，低表达基因的调控网络稳定性一般，大数据集运行速度中等，随着细胞数和基因数的增加，时间会更长。
二、分化轨迹调控法：细胞命运预言家Celloracle
核心原理
首先也是构建高精度GRN，Celloracle基础基因调控网络（base-GRN）的构建有四种方式：可通过染色质可及性数据（单细胞ATAC-seq/批量 ATAC-seq）构建；也可使用软件内置的、覆盖10个物种的预构建启动子调控网络；还能直接导入用户自定义的转录因子-靶基因互作列表完成构建。完成网络构建后，对转录因子开展虚拟敲除，预测细胞分化方向偏移与细胞命运转换，尤其适配发育、造血、神经分化类轨迹研究，可视化呈现效果极强。
图3：Celloracle基础GRN构建方法总结
示例结果
如图4所示，以小鼠造血分化数据为例，正常的造血干细胞/祖细胞（HSPCs）分化轨迹有两个主要分支分化：髓系（GM）分支：GMPs→单核细胞/粒细胞，红系（ME）分支：MEPs→红细胞；Gata1是ME谱系（红系）分化的核心转录因子，也是红系分化的关键促进因子，其缺失会阻断ME程序并抑制髓系终末分化；Spi1是髓系分化的必需因子，其缺失会阻断GM程序，尤其在晚GMP阶段抑制粒细胞生成；不同转录因子具有明确的谱系特异性调控作用，可分为红系特异性、髓系特异性和双谱系调控三类。
图4：Celloracle模拟敲除后分化轨迹改变结果示意图
优缺点
优势：唯一能预测细胞命运转换的虚拟KO工具、可视化极强、适配发育/分化/造血研究、顶刊认可度高；
劣势：仅针对转录因子开展虚拟敲除分析、需scATAC-seq数据（无ATAC数据时精度下降）、本地部署复杂。
三 、大模型掩码法：全基因组高通量神器Geneformer/scBERT
核心原理
Geneformer基于Transformer架构，如图5所示，用数千万级单细胞数据预训练，学习基因间的复杂非线性关系和依赖性，从而获得基因网络的动态调控逻辑。对目标基因Token进行遮蔽（Masking）处理，模型自动推断全转录组扰动效应，小样本也能实现精准预测，是目前顶刊前沿热点方法。简单来说，敲除候选基因后，若疾病细胞转录特征向正常状态逆转，该基因即为潜在治疗靶点。
图5： Geneformer机器学习的策略
优缺点
优势：全基因组高通量、泛化极强、小样本精准、顶刊高频发文；
劣势：部署成本极高、纯黑箱、无本地生物学解释。
四 、在线无代码平台：小白零门槛速通TEDD 2.0
核心原理
TEDD2.0是一个面向发育时序基因表达分析的高级数据库，具备跨物种整合和轨迹推断等前沿计算功能。云端内置9个物种、81种组织类型、42个时间点，收录超1590万个单细胞转录组数据。虚拟基因敲除，纯点击操作、无需编程，适合零基础快速探索。用户打开网址https://tedd.obg.cuhk.edu.hk/ ，输入基因→云端预训练模型一键模拟KO→自动输出结果。
图6：TEDD2.0概览
示例结果
如图7所示，TEDD 2.0对Trem2基因进行虚拟敲除（vKO）后从蛋白互作到功能富集的完整分析结果。从Trem2的蛋白-蛋白互作网络分析，Trem2与Tyrobp存在极高置信度的互作（权重=0.999），这是Trem2信号通路的核心适配分子；vKO差异表达基因汇总表看，表中Tyrobp既是Trem2的直接互作蛋白，也是敲除后表达变化显著的基因之一，提示它们是Trem2调控的核心下游效应分子。Trem2敲除后富集的功能通路，调控的脂质代谢、溶酶体功能、小胶质细胞活化通路被显著扰动，与Trem2在阿尔茨海默病中的已知功能完全吻合。
图7：TEDD 2.0对Trem2基因进行虚拟敲除的分析结果
优缺点
优势：零代码、零算力、极速出结果、物种覆盖广（9大物种）、适合快速筛选和教学演示；
劣势：仅用平台内置数据、无法上传私有数据、参数不可调、分析深度不足，不适合深度课题和高分文章。
五、新手选择指南
1.想发高分文章、做基因机制/细胞亚群功能验证→优先选 scTenifoldKnk；
2.做发育/造血分化、预测细胞命运转换→选 CellOracle；
3.零基础、快速筛靶基因、出演示图→选 TEDD 2.0；
4.做AI生信、全基因组高通量筛选、追求顶刊前沿→选Geneformer/scGen；
5.小样本、跨数据集泛化预测→选 Geneformer。
Tips
虚拟敲除不是“替代实验”，而是高效预筛+机制预判的利器——先用虚拟敲除锁定核心靶基因与通路，再用CRISPR/qPCR/流式验证，干湿结合可让实验周期减半、命中率翻倍，轻松拿捏高分文章的核心逻辑！
参考文献
[1]Osorio D, Zhong Y, Li G, et al. scTenifoldKnk: An efficient virtual knockout tool for gene function predictions via single-cell gene regulatory network perturbation[J]. Patterns, 2022, 3(3).
[2]Lotfollahi M, Wolf F A, Theis F J. scGen predicts single-cell perturbation responses[J]. Nature methods, 2019, 16(8): 715-721.
[3]Theodoris C V, Xiao L, Chopra A, et al. Transfer learning enables predictions in network biology[J]. Nature, 2023, 618(7965): 616-624.
[4]Kamimoto K, Stringa B, Hoffmann C M, et al. Dissecting cell identity via network inference and in silico gene perturbation[J]. Nature, 2023, 614(7949): 742-751.
[5]Chan C C, Lam K K, Chen L, et al. TEDD 2.0: an advanced temporal gene expression database enabled by in-silico functional analyses for developmental mechanism investigation[J]. Science China Life Sciences, 2025: 1-15.
