01.GSEA（基因集富集分析）解决的核心问题是

生物学通路(功能基因集)被激活（上调），还是被抑制（下调）？

02.其分析过程可以概括为以下 4 个关键步骤：

2.1 第一步：排序与定位

将全部基因按与表型的关联程度（例如，处理组 vs 对照组的表达差异 log2FC）从大到小排序，形成“排名列表”，从最相关到最不相关。

2.2 第二步：计算富集分数

沿排名列表扫描，针对预定义基因集计算富集得分（ES）。遇到基因集中的基因时，得分增加（差异越大，增加的幅度就越大）；遇到其他基因时，得分均匀小幅下降。ES为轨迹偏离零点的最大偏差，正值表示富集在顶部（正相关/上调/激活），负值表示富集在底部（负相关/下调/抑制）。

2.3 第三步：评估显著性

通过置换检验评估ES显著性：随机打乱样本或基因标签多次，每次计算随机ES值，构建背景分布。将观测ES标准化为归一化富集分数（NES），并计算名义P值。

2.4 第四步：多重检验校正

因同时检验多个基因集，需校正假阳性。对P值进行校正（如BH方法），得到错误发现率（FDR）。FDR（或者Padj/Qvalue/）< 0.05常作为显著阈值。

03.GSEA结果解析（表格）

以富集分析界扛把子R包——clusterProfiler的GSEA结果为例（如下图所示），一共11列：

每列的含义如下：

•ID：基因集的标识符。 •Description：基因集的描述。 •setSize：基因集中基因的数量。 •enrichmentScore：简称 ES，富集得分，表示基因集在排序列表中的富集程度。 •NES（Normalized Enrichment Score）：标准化富集得分，用于比较不同基因集的富集程度。 •Pvalue：原始 p 值，表示富集得分的统计显著性。 •p.adjust：调整后的 p 值，通常使用多重假设检验校正方法（如 Bonferroni 校正）来调整 p 值。 •qvalue：q 值，另一种多重假设检验校正方法，通常比调整后的 p 值更保守。 •rank：富集得分（ES）达到峰值时，在排序基因列表中所对应的位置。 直观地标定了“富集信号”最强点（波峰/波谷）在榜单上的排名。 •leading_edge：驱动富集信号的核心特征，包含三个百分比： tags（该位置前基因集成员占比）、list（该位置前所有基因占比）、signal（富集信号强度）。 •core_enrichment：对富集贡献最核心的基因列表。通常是位于 leading_edge 区域的基因集成员，即实际产生富集信号的关键基因。

04.GSEA结果可视化（绘图）

拿到富集结果后（如下图的s4对象），便可以根据您的研究需求（想要展示什么），大开画戒了。

4.1 如果您只想展示单个通路

优点：便于突出展示，具体的，单一生物学通路的变化。

方法1：GSEA 图

如下图所示，展示某一个具体的通路的富集情况。图片顶端，Running Enrichment Score 为基因集在分析过程中沿基因排序列表向下遍历时，其运行富集分数 ES（折线）的变化情况。图片中间，条形码部分，黑线显示了基因集成员在基因排序列表中的位置。图片底端，Ranked List Metric显示了随着基因排名列表向下移动，排名指标（log2FC）的值。排名指标衡量基因与表型的相关性（转录组通常用log2FC）。

方法2：Pathview 通路图

以通路图的形式，通过红绿渐变方框展示富集到该通路基因的 log2FC。

方法3：PubMed 富集通路趋势图

富集分析的问题之一是寻找值得进一步研究的通路。enrichplot::pmcplot函数，用于绘制基于 PubMed Central 查询结果的出版物数量/比例趋势图。

4.2 如果您想展示多个通路

优点：便于从系统及网络层面，比较、观察生物学通路的变化，并进行通路的去冗余。

方法1：气泡图

可以直观的看出来哪些通路被激活，哪些被抑制。

方法2：山脊图

按基因集分组，利用每个基因集内各基因的倍数变化值频率生成密度图。有助于解读上调/下调通路。

方法3：Upset 图

可视化基因和基因集（通路）之间复杂关联，它强调不同基因集之间的基因重叠。

方法4：Enrichment Map

富集图将富集的基因集组织成一个网络，网络中的边连接重叠的基因集。这样，相互重叠的基因集倾向于聚集在一起，从而便于识别功能模块。

05.参考教程

以上所有图片均可由r包enrichplot、GseaVis、pathview 包绘制。参考教程如下：

[1]https://yulab-smu.top/biomedical-knowledge-mining-book/

[2]https://cran.r-project.org/web/packages/GseaVis/readme/README.html

[3]https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/pathview.html

关于菲沙基因

武汉菲沙基因信息有限公司（简称菲沙基因）是一家集创新多组学科研技术服务和精准医学检测服务和产品开发于一体的高新技术企业。公司致力于开发创新的高通量多组学和生物信息学技术，建立了包括最新的二代/三代高通量测序、基因组学、三维基因组和表观组学、单细胞时空组学以及生物信息学在内的全方位技术平台，并自主研发了面向不同应用场景的多组学实验技术和全自动化生物信息学数据分析算法和流程，为生命科学和医学研究人员提供科研技术服务并开展科研项目合作。在基因组医学产品和服务方面，公司聚焦于重大疾病精准医学相关检测技术产品开发和服务。公司自成立以来，相继在Cell、 Nature、Science等国际知名期刊上发表合作科研成果，累计合作发表论文600多篇，累计影响因子超过5000。公司已申报和获得国家发明专利62项，获批软件著作权200多项。菲沙基因先后获评国家高新技术企业，国家基因检测应用示范中心、国家级专精特新“小巨人”企业、瞪羚企业、湖北省双创战略团队、武汉市首批千企万人支持计划、“3551“光谷人才计划等支持和荣誉。