CRISPR-Cas9系统的强大功能依赖于精心设计的sgRNA。如何从浩瀚的基因组序列中精准锁定目标位点并预测其效率与特异性？本系列将手把手教你如何使用专业的在线sgRNA设计网站，轻松设计出高成功率的sgRNA。在之前的干货中我们已经介绍了sgRNA的设计原则，大家可以参考学习。

Benchling（https://www.benchling.com/），一款为科研人员提供实验管理、数据追踪和团队协作的全能平台。今天主要介绍它的sgRNA设计功能。

一、注册创建账号

二、新建项目

Create（即侧边栏的“+”）→CRISPR→CRISPR guides

三、导入靶基因信息

1、输入序列。Import from可以选择Ensemble基因ID或基因名、染色体坐标、上传序列文件或手动粘贴输入序列。

接下来以小鼠源Trp53基因为例进行介绍。选择“Gene ID or Name”，输入ID，核对基因组和基因位置信息是否正确。

Transcript一般选择带有CCDS标识的转录本，随后点击“Next”。

2、Guide parameters中，若是单gRNA敲除选Single guide，双gRNA敲除选Paired guides，序列长度默认20 bp。

注意：根据实验用的Cas9类型选择对应的PAM序列，点击“Finish”。

四、Knock-out sgRNA设计

1、选择靶标区域。建议选择靠近起始密码子ATG的外显子设计sgRNA靶点。选中区域后，右边DESIGN CRISPR窗口的Target region自动匹配选中区域位置，点击“+”，即可生成sgRNA序列。

2、设计结果如下。Cut Position：表示sgRNA匹配的位置；Strand：表示靶向的是反义链或反义链，两条链均是有效结合；Guide sequence：sgRNA靶向的基因组序列；PAM序列；On-Target score：中靶评分（表示Cas9的切割效率）；Off-Target score：脱靶评分（Cas9脱靶的相反概率，分数越高意味着该序列与基因组中的其他序列结合的机会越小）。

若选中区域没有设计出位点，则重新勾选其他区域。

五、sgRNA序列的选择

1、On-target score和Off-target score分值越高越好，综合选择两个评分相对较高的靶点。

2、为方便筛选，点击Export all，所有序列信息即保存在剪切板。

3、打开Excel，粘贴序列，选中Specificity score和Efficiency score两列（对应网站中的Off-target score和On-target score），选择excel数据中的筛选功能。

设置Specificity score和Efficiency score均筛选数值大于60。

筛选结果如下，从这些结果中选择合适的sgRNA序列。

六、sgRNA序列转录本比对

1、sgRNA序列应尽可能覆盖靶标基因所有转录本，所以选择sgRNA序列之后，在“snapgene-文件-输入”中输入基因ID，得到靶基因的基因组序列，显示CDS特征。

2、在“snapgene-编辑-查找”中查找上述sgRNA序列，若能匹配转录本共有CDS区，则sgRNA可用。

若sgRNA序列不能匹配所有转录本的CDS区，则需要考虑不匹配的转录本仍可以继续表达，不被敲除的可能性。

七、sgRNA基因组特异性比对

1、选定sgRNA后，复制sgRNA序列，打开NCBI的Blast模块，在BLAST Genomes中选择对应的物种

2、输入选中的sgRNA，点击Blast

3、下拉至详细描述页，可看到靶基因完全匹配对应的基因组，而其它基因均出现不完全匹配现象，说明所选sgRNA在基因组上具备良好的特异性，可用于后续敲除实验。

八、Knock-in sgRNA设计

Benchling网站还可以帮助设计敲入的sgRNA和donor模板。以在小鼠源Trp53基因C端终止密码子前敲入linker-EGFP为例进行介绍。

sgRNA设计操作步骤和上述类似，但需要下拉序列，找到终止密码子位置，选中终止密码子上下游各100 bp序列（Knock in位点与DNA双链断裂距离应不超过100bp，最理想的是不超过10bp，在干货“关于基因Knock-in中donor模板构建的小建议~”中有相应的介绍），设计sgRNA。按照上述方式选择合适的sgRNA序列。

九、Donor模板设计

1、另新建一个项目，点击Create→CRISPR→HR template

2、输入小鼠源Trp53基因ID，选择相同的转录本。

3、选择对应的PAM序列。

4、下拉序列至终止密码子位置，在终止密码子前插入linker-EGFP碱基序列（和word文档操作一样，Ctrl+C、Ctrl+V即可）

这里成功插入了linker-EGFP序列，在右边DESIGN HR TEMPLATE窗口也能看到插入序列的信息，随后点击“Next”。

5、选择同源臂区域（突变片段越大，需要的左右同源臂长度越长，一般在600到2000 bp之间）。这里选择插入位点上下游各1000 bp，右边窗口Template region会自动匹配选中区域的坐标，点击“Next”。此时Benchling自动将左侧序列中多余的基因组序列裁剪掉。

6、为了防止Cas9对于同源重组之后的序列进行二次切割以及防止donor质粒被Cas9识别并切割，可以将donor模板上对应sgRNA的PAM或邻近PAM的序列进行点突变。

所以切换到第七步CRISPR guides项目窗口，复制选中的sgRNA序列。

返回HR template项目窗口，将复制的sgRNA输入右侧的Remove target site，将自动生成点突变，点击“Next”。

7、此时左侧序列为点突变后的donor模板序列，选中所有序列后复制，或点击Copy the template，用于构建donor模板。

以上就是Benchling设计sgRNA的过程，希望能对您有所帮助。下一期，我们将解锁另一个强大的gRNA设计平台——CrispRGold。同时，汉恒生物为您提供从sgRNA设计到CRISPR/Cas9病毒包装一站式产品与服务，如有技术问题或产品订购需求，欢迎随时咨询！