一、慢病毒包装与浓缩

【材料准备】

• 工具细胞：HEK293T（建议使用低传代代次<30）

• 转染试剂：Lipo8000（或同类阳离子聚合物转染试剂）

• 质粒系统：

• 辅助质粒：psPAX2（gag/pol/rev）、pMD2.G（VSV-G）

• 目的质粒：慢病毒载体（含目的基因及WPRE元件）

• • 其他：DMEM高糖完全培养基（含10%优质FBS+1%双抗）

293T细胞接种（关键准备步骤）

① 转染前48小时，用0.25%胰酶消化T25培养瓶中80%融合的293T细胞，按1:3比例接种至10cm培养皿（实际接种密度约2×10^6 cells/dish）

② 培养条件：37℃、5% CO2培养至转染当日，目标融合率70-80%（镜下观察细胞呈单层铺展，细胞间隙清晰可见）提前两天将293T细胞接种到10cm培养皿,使细胞在进行转染的当天达到70-80%融合率

二、慢病毒包装实验步骤

1. 配制转染复合物

按照PAX:PMD:目的质粒的比例为2:1:2进行配制。对于10 cm培养皿，目的质粒用量为15 µg，PAX用量为15 µg，PMD用量为7.5 µg。

• 在无菌1.5 mL离心管中，加入750 µL不含血清和抗生素的培养基。

• 加入15 µg目的质粒、15 µg PAX、7.5 µg PMD，用移液枪轻轻吹打混匀。

• 加入60 µL Lipo8000转染试剂，再次用移液枪轻轻吹打混匀。

• 建议在室温下孵育5-10分钟以确保复合物充分形成。

2. 转染前换液

• 弃去旧培养基，换入10-12 mL新鲜含血清培养基，以提供细胞适宜的生长环境。

3. 转染操作

• 将转染复合物缓慢逐滴添加至培养皿中，轻柔地以8字型晃动混匀，确保转染复合物均匀分布。

• 转染操作记为0点。若转染试剂对细胞状态有影响，可在转然后8-12小时更换新鲜培养基。使用Lipo8000转染后，通常可不更换培养基。

4. 收集病毒液（转染后48小时）

• 转染操作的48小时后，收集细胞培养液。

• 以2000×g离心10分钟去除细胞碎片，即可获得慢病毒的粗病毒液。

• 或使用0.45 µm的针头滤器（PES滤膜）过滤细胞碎片，以进一步纯化病毒液。

5. 浓缩纯化

• 病毒原液经过浓缩纯化后可大大提高病毒滴度和纯度，从而更高效地感染细胞。

• 提前配好PEG8000和NaCl并灭菌后4℃储存。配制方法为：PEG8000（44 g定容至100 mL）、4M NaCl（11.69 g定容至50 mL）。

• 将10 mL病毒原液与2.75 mL PEG8000和1 mL 4M NaCl混合，四度摇床过夜（12-16小时）。

• 4℃下以3000g离心30分钟，弃去上清，用1 mL无血清培养基重悬沉淀。

• 根据需要分装（例如，若需转染两个细胞，将病毒液分装成4份），-80℃冰箱保存（避免反复冻融）。