一、Cas9技术介绍

CRISPR/Cas9系统是近年来革命性的基因编辑工具，以其高效性、精准性和操作简便性在生物医学领域得到广泛应用。该系统由化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)来源的Cas9核酸酶和人工设计的单链向导RNA(single guide RNA, sgRNA)组成。其核心机制在于sgRNA通过碱基互补配对原则识别靶DNA序列，并引导Cas9蛋白在PAM序列(NGG)上游3-4个碱基处产生精确的双链断裂(DSB)。这种断裂随后会触发细胞内源性的DNA修复机制，主要包括易出错的非同源末端连接(NHEJ)和高保真的同源定向修复(HDR)。本实验正是利用这一特性，通过NHEJ修复途径引入随机插入/缺失突变(indels)，造成目的基因阅读框移位和提前终止，从而实现基因功能敲除。

在实验设计方面，完整的CRISPR/Cas9基因编辑流程包括以下几个关键步骤：首先需要进行生物信息学分析，筛选含有规范PAM序列(NGG)且特异性高的靶位点；其次通过分子克隆技术构建包含U6启动子驱动的sgRNA表达框和CMV启动子控制的Cas9编码序列的质粒载体；随后通过脂质体转染或电穿孔等方式将编辑系统递送至靶细胞；最后通过T7E1酶切检测、测序分析等方法验证编辑效率。为提高编辑效率，还可进一步通过慢病毒包装系统建立稳定表达的细胞株。

需要特别注意的是，针对不同物种的基因编辑需求，目前已开发出多种优化的CRISPR载体系统。常见的八种包括：哺乳动物(mammalian)、细菌(bacteria)、果蝇(drosophila)、线虫(elegans)、植物(plant)、酵母(yeast)、斑马鱼(zebrafish)和非洲爪蟾(xenopus)专用载体。这些载体在启动子选择、筛选标记、报告基因等方面存在差异，研究者需要根据实验体系选择匹配的编辑工具。

1. 什么是PAM？

原间隔序列邻近基序（Protospacer Adjacent Motif, PAM） 是一段短而保守的DNA序列（通常为2-6个核苷酸），位于CRISPR-Cas9系统靶向的DNA区域下游，是Cas9核酸酶识别和切割靶DNA的必要条件。PAM序列的存在允许Cas9蛋白区分宿主自身基因组（含有CRISPR阵列）和外源入侵DNA（如病毒或质粒），从而确保精确的基因编辑。

PAM的关键特性：

1. 位置与功能：PAM位于目标DNA上，但不在引导RNA（crRNA或sgRNA）的匹配序列中。

2. 序列依赖性：不同来源的Cas9蛋白识别不同的PAM序列。例如：

   • 化脓链球菌Cas9（SpCas9）：经典PAM为NGG（N代表任意核苷酸）。

   • 其他变体（如SaCas9、Cpf1等）：可能识别NNGRRT、TTN等不同PAM序列。

1. 切割机制：若靶DNA缺乏PAM，即使序列完全匹配，Cas9也无法结合和切割，这为CRISPR系统提供了额外的特异性保障。

2.LentiCRISPR v2质粒图谱

该质粒包含两个关键表达元件：

2. ①hSpCas9表达框：由EFS（EF-1α short）启动子驱动的人源化化脓链球菌Cas9（hSpCas9）核酸酶

3. ②嵌合向导RNA（sgRNA）表达框：由U6启动子调控的sgRNA转录单元

主要克隆流程：

1. ③BsmBI酶切位点：质粒经BsmBI限制性内切酶消化后，可在线性化载体中插入设计的寡核苷酸对

2. sgRNA插入设计：

   • 靶向序列设计为20bp，需与目标DNA完全互补配对

   • 3'端必须包含NGG PAM识别序列（其中N为任意碱基）

   • 需设计一对互补的寡核苷酸，经退火形成双链后克隆至载体

技术优势：

2. 慢病毒递送系统：可通过慢病毒包装实现高效的细胞转导

3. 嘌呤霉素抗性：包含PuroR筛选标记，便于稳定细胞系的建立

4. 广谱应用性：适用于多种哺乳动物细胞的基因编辑

实验注意事项：

• 靶序列设计需避免脱靶效应，建议使用CRISPR设计工具进行特异性评估

• 转染后需通过测序验证sgRNA的正确插入

• 可配合报告基因（如GFP）共转染以提高转染效率监测

二、靶向序列选择原则与流程

1.靶向序列的选择原则

CRISPR/Cas9系统靶位点的选择是基因编辑实验成功的关键环节，需要综合考虑多个因素以确保编辑效率和特异性。以下是基于最新研究进展和实验验证的靶位点选择原则：

①PAM序列要求：必须选择NGG（其中N为A/T/C/G任一碱基）作为PAM序列，并以其上游20个核苷酸作为靶向序列。值得注意的是，近年开发的Cas9变体（如SpCas9-NG）可识别NG等更宽松的PAM序列，扩大了靶位点选择范围；

②特异性保障：需要通过BLAST比对确保靶序列在基因组中的唯一性，建议使用CRISPR设计工具（如CRISPOR或CHOPCHOP）进行全基因组脱靶效应预测，选择脱靶风险最低的位点；

③ GC含量优化：理想的GC含量应控制在40%-60%之间。过高GC含量（>70%）可能导致sgRNA二级结构不稳定，而过低（<30%）则可能影响结合效率。同时需避开已知的CpG甲基化位点；

④转录起始要求：为适应U6启动子的转录特性，靶序列应以G（最优）或A开头，确保sgRNA的高效转录。若必须选择以C/T开头的靶位点，可考虑添加额外的G作为转录起始；

⑤ 靶位点定位策略：优先选择基因5'端的外显子区域，特别是编码重要功能域的区域。对于功能研究，建议在多个外显子上设计2-3个靶位点，以提高基因敲除效率。对于治疗应用，需特别关注常见转录变体的共享外显子。

需要特别强调的是，即使严格遵循上述原则设计的gRNA，其编辑效率仍可能受染色质状态、局部DNA二级结构等因素影响。因此，建议针对每个靶基因设计3-5个候选gRNA，并通过实验验证其编辑效率。

2. 靶序列的选择流程：以ADAM12基因为例

①获取基因序列信息

首先在NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中检索ADAM12基因，获取其完整的cDNA序列（建议选择RefSeq标准序列如NM_003816.5）。重点分析5'端第一个外显子区域，该区域通常包含起始密码子ATG，是理想的基因敲除靶点。建议同时下载基因组序列以明确外显子-内含子边界信息。

②在线gRNA设计与评分

将目标外显子序列提交至以下专业设计平台：

• MIT CRISPR设计工具（http://crispr.mit.edu/）：选择对应参考基因组（人类hg38或小鼠mm10等最新版本），系统将基于算法给出候选gRNA的评分（0-100分）。评分综合考虑了：

  • 靶向特异性（通过全基因组比对评估脱靶风险）

  • 序列特征（GC含量、二级结构等）

  • 预测编辑效率（基于已发表的实验数据模型）

• CRISPR-ERA（http://crispr-era.stanford.edu/）：该平台提供更全面的脱靶分析，可识别潜在的同源序列干扰。建议将两个平台的结果交叉比对，筛选出3-5个高评分候选序列。

③靶序列优化选择

优先选择满足以下标准的序列：

• MIT评分≥80分

• 脱靶位点≤3个（且错配≥3个碱基）

• GC含量40-60%

• 5'端为G（最优）或A

• 位于基因功能关键区域（如催化结构域编码区）

④sgRNA寡核苷酸设计

根据选定靶序列设计互补寡核苷酸对：

• 正向序列：5'-CACCG[N20]-3'

• 反向序列：5'-AAAC[N20revcomp]C-3'

• （其中[N20]为20bp靶序列，[N20revcomp]为其反向互补序列）

三、举例说明

1. CRISPR-ERA在线工具操作指南

步骤一：访问平台

打开CRISPR-ERA设计网站（http://crispr-era.stanford.edu/index.isp），该平台由斯坦福大学开发，整合了多项CRISPR设计算法和基因组数据库。

步骤二：参数设置

1. 在首页界面选择"Using nuclease"选项

2. 默认选择SpCas9（最常用的Cas9核酸酶变体）

3. 比对基因组选择人类GRCh37/hg19（建议新项目优先选择更新的GRCh38/hg38版本）

步骤三：输入靶基因信息

1. 在Step3输入框中可以输入：

   • 基因官方符号（如TP53、BRCA1等）

   • NCBI Gene ID

   • 特定基因组坐标（如chr7:140453136-140453156）

   • 直接粘贴目标DNA序列（建议50-200bp）

步骤四：执行分析

点击"CRISPR-ERA search"按钮后，系统将：

1. 自动检索基因的所有外显子区域

2. 扫描所有可能的gRNA靶位点（NGG PAM）

3. 进行全基因组脱靶分析

4. 计算每个位点的编辑效率预测值

结果解读：

生成的报告包含多个关键指标：

• 靶向效率评分（0-100分）：基于序列特征和实验数据建模

• 脱靶位点列表：显示潜在脱靶位置及错配数

• 基因组注释：显示靶位点在基因结构中的位置

• 序列特征：包括GC含量、二级结构预测等

2. 多平台交叉验证策略

方法一：CRISPR-ERA与MIT工具联用

1. 从CRISPR-ERA获得的候选序列需进行以下格式处理：

   • 靶DNA链上的PAM序列（需包含在输入序列中）

   • sgRNA中的互补序列（不包含PAM）

   • 保留20bp靶向序列

   • 手动添加NGG PAM序列（如：GACCTCAGGCGGCTCATCCG→GACCTCAGGCGGCTCATCCG[NGG]）

   • 注意区分：

1. 提交至MIT CRISPR设计平台（http://crispr.mit.edu/）：

   • 最佳长度范围：120-200bp（包含靶位点上下游各50-100bp）

   • 复杂序列可先使用UCSC Genome Browser获取基因组背景信息

   • 姓名建议使用拼音全称（如Zhang San）

   • 邮箱需使用机构邮箱（.edu/.ac.cn）以获得更完整报告

   • 注册信息填写规范：

   • 序列输入技巧：

方法二：直接使用MIT设计平台

1. 平台使用规范：

   • 最大250bp（建议控制在230bp以内以防截断）

   • 避免包含特殊字符或空格

   • 人类研究优先选择hg38

   • 小鼠研究选择mm10

   • 基因组版本选择建议：

   • 序列提交限制：

1. 结果获取与解读：

   • 综合评分（含效率分和特异性分）

   • 预测的脱靶位点列表

   • 二级结构预测图

   • 简单序列：10-15分钟

   • 复杂区域：可能延长至30分钟

   • 典型等待时间：

   • 报告内容解析：

3.选择靶序列后,将序列连入LentiCRISPRv2质粒中,在两条oligo两端加酶切位点。

4.退火

按以下体系在 0.2 mL PCR 管中配制反应液：

• NEB Buffer 2（10×） 1 µL

• 上游引物（100 µM） 1 µL

• 下游引物（100 µM） 1 µL

• ddH₂O 7 µL

总体积 10 µL

瞬时离心后置于 PCR 仪，按如下程序退火：

95 °C 5 min（变性）→ 95 °C → 25 °C 梯度降温，每 90 s 降低 1 °C，总时长约 70 min。

（或简化为：95 °C 5 min → 以 −2 °C/4 min 阶梯降温至 25 °C，全程约 1.5 h。）退火完成后，立即将产物用 ddH₂O 稀释 200 倍（例如 1 µL 退火产物 + 199 µL ddH₂O），混匀后短暂离心，-20 °C 保存或直接用于后续连接/转录反应。

5.酶切载体

6.连接

7.转化,挑取菌落,提取质粒,酶切验证(BsmBI),测序。

1. 如果正确插入是一条带,大小13000bp。没有插入是两条带,

2. 5391bp和9482bp。只能排除部分,最终还是需要测序验证。

3. 8.转染细胞,筛选敲除效率高的质粒进行慢病毒包装。

4. 9.慢病毒包装,感染目的细胞,筛选构建稳株。

5. 37 °C 反应 30 min，1% 琼脂糖凝胶（含 GelRed）电泳 120 V 20 min：

6. • 正确重组：单一条带 ≈ 13 000 bp；

7. • 空载体或错误重组：两条带 5 391 bp 与 9 482 bp。

8. 仅保留 13 000 bp 单一条带的克隆，以 M13F/R 通用引物进行双向 Sanger 测序，确保 sgRNA 序列及载体骨架无误后，再进入下游病毒包装。

9. 重组LentiCRISPR v2质粒经双酶切后的琼脂糖凝胶电泳图。图为插入

10. ADAM12上述靶序列的重组LentiCRISPR v2质粒,M为DNA marker,1-4泳道分别代表不同菌落提取质粒后的双酶切结果,N为LentiCRISPR v2质粒空载体双酶切结果。取3进行测序。

11. 10.酶切验证

12. 连接产物转化 Stbl3 感受态后，于 37 °C 孵育 12 h，挑取 3–5 个独立单菌落，用碱裂解法提取质粒。随后以 Cla I 与 BamH I 进行双酶切初筛，体系（10 µL）：

13. • 重组 LentiCRISPR v2 质粒 500 ng

14. • Cla I 1 µL（10 U）

15. • BamH I 1 µL（10 U）

16. • 10× CutSmart Buffer 1 µL

    1. • 无核酸酶水补足至 10 µL