多重荧光免疫组织化学 (mIHC) 是一种可以在单个样本中同时检测多个靶标蛋白表达的强大工具。上一篇文章手把手教学｜多重荧光免疫组织化学（一）：基本原理与实验流程 讲解了实验原理以及大致流程，这篇文章将详细讲解mIHC实验的具体步骤，帮助研究者更好地掌握这项技术。
1. 切片、烤片及烘片
切片
·使用粘附载玻片，切片厚度为5微米。若使用组织芯片，则需准备与组织芯片类型相对应的常规组织切片进行预实验条件摸索。
烤片
·切片后立即烤片：先在60℃条件下烘烤6-8小时，再在40℃条件下过夜烘烤。切片需避光保存，并在一个月内使用。
·实验前，将石蜡切片60℃烘片1小时。
2. 脱蜡水合
脱蜡
·用新鲜二甲苯浸片10分钟，重复3次，或浸片30分钟，重复2次。
梯度乙醇浸片
·分别用100%、95%、90%、80%的乙醇浸片，每次5分钟。
·使用灭菌水洗片1分钟，重复3次。
3. 后固定
·用10%中性福尔马林浸片10分钟。
·用灭菌水洗片1分钟，重复3次。
4. 封闭内源性过氧化氢酶（可选）
·新鲜配制3% H2O2溶液：20ml H2O2（30%）+180ml Millipore H2O。
·用3% H2O2浸片15分钟。
·水洗3次，每次1分钟。
5. 微波修复抗原
·将抗原修复液放入修复杯中，在微波炉内高火5分钟至煮沸。
·将脱蜡水合后的玻片放入预煮沸的抗原修复液中，确保玻片全部浸没。
·微波低火维持15分钟（注意补液，防止蒸发过度导致干片）。
·将玻片取出，放入冰水浴中冷却至室温。
6. 封闭
·去除玻片上残留的洗液。
·用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加封闭液覆盖样本区域。
·室温保湿振荡10分钟。
7. 一抗孵育
·去除玻片上的封闭液。
·用移液器滴加稀释的一抗溶液，浸没样本区域。
·室温或37℃保湿振荡孵育1-2小时（根据不同抗体做优化调整）。
·用1×TBST buffer浸洗玻片3分钟，重复3次。
8. 二抗孵育
·去除玻片上残存的洗液。
·直接滴加HRP标记的二抗工作液，浸没样本区域。
·室温保湿孵育10分钟。
·用1×TBST buffer浸洗玻片3分钟，重复3次。
9. 荧光染色放大信号
·去除玻片上残存的洗液。
·滴加1×TSA染料工作液100μl（用信号放大反应液按1:100稀释），浸没样本区域。
·室温保湿振荡孵育10分钟。
·用1×TBST buffer室温浸洗玻片3分钟，重复3次。
·微波修复洗脱，室温自然冷却至室温。
·灭菌水洗片1次，用1×TBST buffer洗2分钟。
10. 追加染色
·重复步骤5至9进行多重染色。
11. 封片
·去除玻片上残存洗液，滴加DAPI工作液，室温保湿孵育10分钟。
·用1×TBST buffer浸洗玻片，室温3分钟，重复3次。
·用灭菌水洗片。
·待玻片微干，用移液器在玻片上滴加抗淬灭封片剂，浸没样本区域。
·加盖玻片，用指甲油封片。
12. 阅片
·使用激光共聚焦荧光显微镜或多光谱组织成像系统观察和成像，并进行结果判读。
本文作者是"林林"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
文稿：林林
校对：煲仔饭
素材：
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