这是另一种蛋白互作验证，也可以验证蛋白与RNA，RNA与RNA的相互作用

该步骤由程BS提供

  1. 实验原理   Luciferase 报告基因系统是以荧光素(luciferin) 为底物来检测萤火虫荧光素酶 (fireflyluciferase)活性的一种报告系统。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪 (luminometer)或液闪测定仪测定 luciferin 氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素 酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因 启动子区 DNA 相互作用的一种检测方法，也可以用于检测 miRNA 与其靶基因的靶向作用。   2. 实验目的   验证转录因子与目的基因启动子区 DNA 相互作用。   3. 实验材料   3.1. 主要试剂   荧光素酶报告基因检测试剂盒（E1910） 被动裂解缓冲液（PLB） 萤光素酶检测试剂II（LAR II） 终止液 Stop & Glo Reagent   4. 实验步骤       （1）用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点（若目标是检测   miRNA 及其靶基因的靶向作用，则需要预测两者结合位点）。   （2）设计引物用 PCR 法从基因组 DNA 中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧 光素酶报告基因质粒（如 pGL3-basic）中。 （3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。   （4）扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。   （5）培养 293T（或其它目的细胞），并接种于 24 孔板中，生长 10-24 小时。   （6）将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。

（7）质粒共转染 48h 后，弃去培养基，用 100μl 1XPBS 洗 1 遍。

（8）倾斜 96 孔板，吸干剩余的 PBS。

（9）去离子水将 5 X PLB 稀释成 1 X PLB，使用前放到常温。

（10）每孔加 50μl 稀释好的 1X PLB，摇床常温条件下摇 15min，进行裂解。

（11）白色不透光的 96 孔酶标板中每孔加步骤（10）的上清液 10μl，加入 100μl 预 先混好的 LAR II，2s 后测数据。

（12）每孔添加 100μl 预先混好的 Stop&Glo Reagent，静止 2s 后，测数据。 注意：进行 Luciferase 活性检测时，需在避光条件下进行。