Linker在重组蛋白构建中的重要性
成功构建重组融合蛋白需要两个不可或缺的要素：组成蛋白和连接蛋白。选择合适的Linker将蛋白质结构域连接在一起可能比较复杂，在设计融合蛋白时往往被忽视。没有Linker的功能域直接融合可能会导致许多不良后果，包括融合蛋白的错误折叠、蛋白质产量低或生物活性受损。
与重组融合蛋白类似，天然存在的多域蛋白也是由两个或多个功能域通过连接肽连接而成。这些连接肽起到连接蛋白质分子的作用，同时还具有许多其他功能，如保持结构域间的相互作用或保持生物活性。了解多链蛋白中的天然连接肽对合理设计重组融合蛋白中的经验连接肽非常有帮助。
天然Linker中氨基酸的选择
对天然Linker的一些特性，如长度、疏水性、氨基酸残基和二级结构进行了比较。一般来说，首选氨基酸是极性不带电或带电残基，它们约占天然编码氨基酸的 50%。Pro、Thr和Gln是天然Linker的首选氨基酸。其中，Pro是一种独特的氨基酸，其环状侧链导致其构象非常受限。Pro上缺乏酰胺氢可能会阻碍与其他氨基酸形成氢键，从而降低Linker与蛋白质结构域之间的相互作用。因此，加入Pro残基可能会增加Linker的硬度和结构独立性。Thr或Ser和Gly等小的极性氨基酸是有利的，因为它们体积小，可以提供良好的灵活性，还可以通过与水形成氢键来保持Linker结构在水溶剂中的稳定性。
天然Linker的构象
天然Linker在二级结构中采用各种构象，如螺旋、β 链、盘绕/弯曲和转向等，以发挥其功能。大多数Linker平均呈现α-螺旋或线圈/弯曲二级结构。
螺旋Linker：α-螺旋是一种刚性稳定结构，具有内部氢键和紧密的骨架。一些α-螺旋构象在折叠过程中迅速形成，可使连接蛋白质结构域正确折叠，而不会与Linker发生非本源相互作用。α-螺旋结构中的Linker还可以作为刚性间隔物，有效地分隔蛋白质结构域，减少它们之间的不利相互作用。
非螺旋Linker：由于没有固有的刚性结构，非螺旋Linker往往富含 Pro，可能会增加Linker的刚性。因此，富含 Pro 序列的非螺旋Linker可以表现出相对坚硬的结构，并起到减少域间干扰的作用。
融合蛋白Linker选择
Linker主要采用延伸构象，具有独立的结构，不会与相邻的蛋白质结构域发生相互作用。它们的长度、组成、疏水性和二级结构对于实现理想的功能都很重要。
柔性Linker
当连接的结构域需要一定程度的移动或相互作用时，通常会使用柔性Linker。它们通常由小的非极性（如 Gly）或极性（如 Ser 或 Thr）氨基酸组成。这些氨基酸的小尺寸提供了灵活性，并允许连接功能域的移动。加入 Ser 或 Thr 可通过与水分子形成氢键来保持Linker在水溶液中的稳定性，从而减少Linker与蛋白质分子之间的不利相互作用。
最常用的柔性Linker的序列主要由甘氨酸和丝氨酸残基组成（“GS ” ）。例如(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n。通过调整拷贝数 “n”，可以优化 GS 连接器的长度，以实现功能域的适当分离，或保持功能域之间必要的相互作用。柔性Linker也可以含有额外的氨基酸（如 Thr 和 Ala）以保持柔性，也可以含有极性氨基酸（如 Lys 和 Glu）以提高溶解度。
如EGKSSGSGSESKST, Gly和Ser残基提供柔性, Glu和Lys增加可溶性；
(Gly)8可以增加表位对抗体的可及性或改善蛋白质的折叠；
GSAGSAAGSGEF避免了大的疏水残基，以保持在水溶液中的良好溶解性；
柔性Linker的长度可以调整，以便进行适当的折叠或使融合蛋白具有最佳生物活性。
刚性Linker
某些情况下，柔性Linker效果不佳的原因是蛋白质结构域的分离效率不高，或者没有充分减少它们之间的相互干扰。所以刚性Linker被成功地应用于保持结构域之间的固定距离，并保持它们的独立功能。
序列为 (EAAAK)n 的α螺旋Linker已被用于构建许多重组融合蛋白，α螺旋结构坚硬稳定，具有段内氢键和紧密的骨架，可作为蛋白质结构域之间的刚性间隔。可以通过改变EAAAK基序的重复次数来控制结构域之间的距离。
另一种非α螺旋刚性Linker具有富含 Pro 的序列 (XP)n，X 表示任何氨基酸，最好是 Ala、Lys 或 Glu。 Pro 的存在可以增加刚性，从而有效分离蛋白质结构域。
A(EAAAK)nA（n = 2-5）。该Linker显示出 α 螺旋构象，并通过片段内的 Glu- -Lys+ 盐桥而得到稳定。
有重复-Glu-Pro-或-Lys-Pro-的 33 个残基肽的研究也表明，X-Pro 主干显示出相对较长的刚性构象。
因此，当结构域的空间分离对保持融合蛋白的稳定性或生物活性至关重要时，就会选择刚性Linker。
体内可切割Linker
稳定的Linker将功能域共价连接在一起，在整个体内过程中作为一个分子发挥作用。然后这些Linker有一些潜在的缺点，包括功能域之间的空间位阻、生物活性降低，以及由于功能域之间的干扰而改变蛋白质分子的生物分布和代谢。因此有时候会利用体内可切割的Linker。
可切割的Linker利用了独特的体内过程，可在特定条件下（如存在还原试剂或蛋白酶）裂解。可减少空间位阻，提高生物活性，或在Linker裂解后实现重组融合蛋白单个结构域的独立作用。
利用二硫键的可逆性，设计了二硫Linker（LEAGCKNFFPR↓SFTSCGSLE）基于一个二硫环肽，Linker上的两个半胱氨酸（Cys）残基之间含有一个分子内二硫键，两个半胱氨酸残基之间还有一个凝血酶敏感序列（PRS）。
例如将这种Linker插入 G-CSF 和 Tf 之间，构建了一个模型融合蛋白（命名为 "G-C-T"）。体外凝血酶处理 G-C-T 后，凝血酶敏感序列被裂解，而融合蛋白两个结构域之间的可逆二硫连接仍然存在。由此产生的二硫键连接蛋白被命名为 "G-S-S-T"。
体内可裂解Linker通过加入特定的蛋白酶敏感序列，设计成可对特定蛋白酶产生作用。许多蛋白酶的特异性使Linker在受限区室中的裂解速度较慢。这种可裂解Linker可用于在体内特定部位激活融合蛋白的生物活性。
三类天然Linker总结
🔵柔性Linker通常富含小分子或亲水性氨基酸（如甘氨酸或丝氨酸），以提供结构上的灵活性。
🔵在需要充分分离蛋白质结构域的情况下，刚性Linker可能更为可取。通过采用 α 螺旋结构或加入 Pro，刚性Linker可以有效地保持蛋白质分子之间的距离。
🔵柔性Linker和刚性Linker在体内都很稳定，不会使连接的蛋白质分离。而可裂解Linker则可以通过还原或蛋白酶裂解的方式在体内释放游离的功能域。它们可用于提高嵌合蛋白的生物活性，或将原药特异性地输送到目标部位，在这些部位，Linker经过处理后可激活生物活性。
Linker设计数据库
LINKER 的程序，它可以根据用户指定的输入（如连接子长度、需要避免的蛋白酶敏感序列）搜索连接子序列数据库，并生成符合标准的序列输出。
该程序的基本输入是所需的连接序列长度，以残基数或距离（埃）表示。其他输入参数包括需要避免的蛋白酶或限制性内切酶的潜在裂解位点，以便所选连接子在克隆过程中对指定的蛋白酶稳定或对限制性酶有抵抗力。
还可以加入氨基酸组成偏好（如去除大块疏水残基），以进一步选择感兴趣的连接体。该程序可作为生成连接体序列的便捷工具，这些序列是在 X 射线晶体或核磁共振溶液结构中观察到的loop。
阿姆斯特丹自由大学的 VU 综合生物信息中心（IBIVU）。搜索算法可接受多种查询类型（如 PDB 代码、PDB 标头、连接子长度、C-α 范围、溶剂可及性、二级结构或序列）。
该程序可提供符合搜索条件的连接体序列，还可提供其他信息，如源蛋白质的 PDB 代码和简要说明、连接体在源蛋白质中的位置、连接体长度、溶剂可及性和二级结构。用户可以搜索具有所需特性的序列，并从天然多域蛋白质中获取候选序列。
